by G. H. | Nov 26, 2018 | Arthrosetherapie, News
ROBUST-Regeneration of osteoporotic bone using stem cell transplantation
Saxer F, Studer P, Miot S, Todorov A, Schaefer D, Martin I, Scherberich A, Jakob M
Fragestellung: Ist die Nutzung nicht-expandierter undifferenzierter Zellen der stromal vaskulären Fraktion (SVF) des menschlichen Fettgewebes als zelluläre Komponente eines Composite-Grafts zur biologisch aktiven Augmentation von Knochendefekten und Frakturen im Tiermodell bzw. der Klinik möglich?
Methodik: SVF Zellen wurden aus dem Fett menschlicher Spender nach Enzymverdau anhand des Dichtegradienten isoliert. Sie wurden mittels Fibrin Gel auf Hydroxyapatit-Träger (Actifuse, Baxter, USA) aufgebracht und in Femurdefekte kritischer Grösse athymer Ratten (Crl:NIH-Foxn1mu, Charles River, Deutschland) implantiert, die mittels RatFix System (RISystem AG, Schweiz) stabilisiert wurde. Nach 8 Wochen in vivo wurden die Femora entnommen und histologisch, sowie biomechanisch untersucht. Im Rahmen einer Sicherheits- und Machbarkeitsstudie erfolgte die Translation des Ansatzes. Patienten mit Indikation zur offenen Reposition und Osteosynthese einer osteoporotischen proximalen Humerusfraktur wurden bei entsprechender Einwilligung und Eignung ca. 300 ml Fett per Liposuction entnommen. Aus dem Aspirat wurde im Cellution800/CRS (Cytori, USA) die SVF isoliert und nach o.g. Prinzip zur Zellularisierung eines Grafts genutzt, mit dem die Fraktur augmentiert wurde. Protokolldeviationen und Komplikationen wurden dokumentiert. Im Fall einer Implantatentfernung wurde eine Biopsie entnommen. Die implantierten Zellen wurden im Tiermodell und der klinischen Studie anhand ihrer Oberflächenmarker und Klonogenität charakterisiert.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Im Tiermodell konnte in 2/3 der Behandlungsgruppe das Auftreten von Knochen und Gefässen humanen Ursprungs nachgewiesen werden. In 1/3 der Fälle wurde eine Torsionsstabilität ähnlich der physiologischer Rattenfemora nachgewiesen. Nach Implantation zellfreier Grafts traten instabile Pseudarthrosen ohne histologischen Knochennachweis auf. 6 Patienten wurden bisher in die klinische Studie eingeschlossen. Grobe Protokoll-Deviationen oder prozesstechnische Schwierigkeiten gab es nicht. Die Patienten tolerierten den Zusatzeingriff gut. Durchschnittlich wurden 137 Mio Zellen (32-220 Mio) implantiert. Bei 3 Patienten kam es zu relevanten Komplikationen, die nicht auf die Implantation des Grafts zurückzuführen waren. In zwei bereits entnommenen Biopsien nach 6 bzw. 32 Wochen fand sich Osteoid bzw. Knochen im Graft. Die isolierten Zellen zeigten eine durchschnittliche Klonogenität um 10% mit osteogenem Potenzial in 1/3. 60% exprimierten mesenchymale Marker, 10% endotheliale, deren Proportionen jedoch ohne erkennbaren Einfluss auf das klinische Ergebnis waren.
Dieser einzeitige Ansatz zur Herstellung eines osteo- und vaskulogen aktiven Grafts ist in der klinischen Anwendung sicher und machbar. Er umgeht die Morbidität eines autologen Knochengrafts, sowie bei Osteoporose die Dysfunktionalität der darin enthaltenen Stammzellen. Zudem fördert er die Vaskularisierung des Gewebes. Insgesamt handelt es sich insofern um eine vielversprechende Technik, deren Effektivität zu beweisen wäre.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR13-481
doi: 10.3205/14dkou482, urn:nbn:de:0183-14dkou4821
Published: October 13, 2014
© 2014 Saxer et al.
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by G. H. | Nov 26, 2018 | Arthrosetherapie, News
Die Etablierung eines Infektpseudarthrose-Modells an der Ratte
Helbig L, Rosenberger S, Becker S, Ivanova A, Moghaddam-Alvandi A, Schmidmaier G
Fragestellung: Die Behandlung nicht heilender Knochendefekte, insbesondere bei einer infektionsbedingt verzögerten Knochenbruchheilung, stellt nach wie vor eine große Herausforderung für die Orthopädie und Unfallchirurgie dar. Die Inzidenz von Infektionen nach komplexen Frakturen ist hoch. Insbesondere bei offenen Frakturen mit großem Weichteilschaden entwickeln Patienten nicht selten infektbedingte Pseudarthrosen. Das Ziel dieser Studie ist, ein Tiermodell zu etablieren, mit dem Therapiekonzepte zur Behandlung einer infektionsbedingt verzögerten Knochenbruchheilung in vivo untersucht werden können.
Methodik: Bei 20 Ratten wurde die rechte Tibia mit einer Frakturmaschine frakturiert und im Anschluss mit einem intramedullären K-Draht osteosynthetisch versorgt. Nach Randomisierung wurden 10 Tiere mit einem Staph. aureus Stamm (1000 CFU) vor Implantation des K-Drahtes intramedullär infiziert. Während der Standzeit von 4 Wochen wurden die laborchemischen Infektparameter, das Gewicht und die Körpertemperatur regelmäßig bestimmt. Nach 4 Wochen erfolgten die biomechanische Torsionsmessung als Maß für die knöcherne Konsolidierung, sowie eine mikrobiologische Untersuchung des entfernten K-Drahtes. Außerdem wurde eine µCT-Unteruchung der Frakturregion durchgeführt und mit Hilfe des modifizierten Lane Sandhu Scores ausgewertet.
Ergebnisse: Die laborchemischen Infektparameter, das Körpergewicht und die Körpertemperatur lagen für alle Tiere über den gesamten Verlauf im Normbereich bzw. haben sich nicht signifikant verändert. Bei allen infizierten Tieren konnte in der Mikrobiologie der Staph. aureus Stamm nachgewiesen werden. Die nicht infizierten Tiere waren mikrobiologisch blande. Die biomechanische Torsionsmessung ergab bei den infizierten Tieren signifikant (p<0,05) geringere maximale Torsionswerte (Durchschnittswert: 0,06 Nm) als bei den nicht infizierten Tieren (0,13 Nm). Die µCT-Unteruchung ergab im modifizierten Lane Sandhu Score bei den infizierten Tieren signifikant (p<0,05) schlechtere Scorewerte (Median: 1) als bei den nichtinfizierten Tieren (Median: 4).
Schlussfolgerung: Im Rahmen der Studie konnte das beschriebene Infektpseudarthrose-Modell an der Ratte etabliert werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das Modell geeignet ist, in weiterführenden Studien verschiedene Therapieansätze in der Behandlung der Infektpseudarthrose zu überprüfen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR13-850
doi: 10.3205/14dkou481, urn:nbn:de:0183-14dkou4811
Published: October 13, 2014
© 2014 Helbig et al.
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by G. H. | Nov 26, 2018 | Arthrosetherapie, News
Analyse der Heilungsverläufe bei Femurpseudarthrosen mit einem instrumentierten Implantat
Riha T, Kowald B, Münch M, Seide K, Jürgens C, Faschingbauer M
Fragestellung: Heilungsverläufe nach Pseudarthrosen sind sehr unterschiedlich. Röntgenbilder ermöglichen ausschließlich eine Aussage über die Kalzifizierung. Telemetrisch instrumentierte (intelligente) Implantate bieten eine Möglichkeit des quantitativen Monitorings der mechanischen Konsolidierung. Ziel der Studie war die Suche nach Parametern zur Klassifizierung der Heilungskurven und deren Analyse.
Methodik: Das System besteht aus einer winkelstabilen Platte, auf die eine Elektronikeinheit zur Messung der Biegelast im Implantat aufgebracht wird, einem externen Lesegerät und einem Bodensensor zur Messung von extern applizierter Last. Durch Korrelation extern auf die Extremität aufgebrachter Lasten mit der Last im Implantat wird die Elastizität der Osteosynthese bestimmt. Diese nimmt mit zunehmender Konsolidierung der Pseudarthrose ab und ist geeignet den Verlauf der Knochenheilung zu quantifizieren.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Anwendung bei Femurpseudarthrosen erfolgte in 35 Fällen. Es ließen sich 4 Heilungstypen differenzieren. 10 schnell heilende Patienten zeigten einen steilen Abfall der Elastizität nach zirka 12 Wochen. 18 langsam heilende Patienten zeigten einen geringen jedoch kontinuierlichen Abfall der Elastizität über bis zu 74 Monate, danach letztlich die knöcherne Konsolidierung. In 5 Fällen war die Elastizität der Osteosynthese über längere Zeit im Sinne eines Plateaus konstant, um dann im späteren Verlauf schnell auf niedrige Werte abzufallen. Ein weiterer Typ (2 Patienten) entsprach nahezu konstant bleibenden Werten über 40 Wochen im Sinne einer ausbleibenden Konsolidierung, wobei die Behandlung noch nicht abgeschlossen ist. Die gemessene Anfangselastizität der Osteosynthese in der Gruppe der langsam heilenden Patienten war signifikant um den Faktor 1,6 höher (p=0,020) als in der Gruppe der schnell heilenden Patienten.
Mit dem Intelligenten Implantat war es möglich, Heilungsverläufe von Femurpseudarthrosen kontinuierlich zu kontrollieren, verschiedene Typen von Verläufen zu differenzieren und somit Patient und Arzt optimale über das CT hinausgehende Entscheidungsgrundlagen zu geben.Die primäre Stabilität der Reosteosynthese beeinflußt signifikant den Heilungsverlauf.Die Definition einer erneuten Pseudarthrose über einen festen Zeitpunkt von 6 oder 8 Monaten ist zu überdenken.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR13-575
doi: 10.3205/14dkou480, urn:nbn:de:0183-14dkou4802
Published: October 13, 2014
© 2014 Riha et al.
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by G. H. | Nov 20, 2018 | Arthrosetherapie, News
Erhöhtes angiogenes Potenzial von GDF-5 und einer GDF-5 Mutante gegenüber BMP-2 bei der Regeneration von Röhrenknochendefekten im Kaninchen
Kleinschmidt K, Wagner-Ecker M, Bartek B, Holschbach J, Rütze M, Richter W
Fragestellung: Die Verwendung von Knochenersatzmaterialien zur Applikation von Wachstumsfaktoren, vor allem aus der Familie der bone morphogenetic proteins (BMPs) hat sich für die Stimulation der Knochenneubildung bewährt. Die Nachverfolgung von Neoangiogenese im Heilungsverlauf beim Einsatz dieser Faktoren wird aber aufgrund der hohen Röntgendichte erschwert. In einer kürzlich veröffentlichten Studie konnte gezeigt werden, dass eine Mutante des pro-angiogenen Wachstumsfaktors growth/differentiation factor 5 (GDF-5) mit neu erworbener BMP1A-Rezeptor Affinität (BB-1) zu einer Stimulation der Knochenneubildung in langen Röhrenknochendefekten des Kaninchens führt, die dem klinischen Standard BMP-2 überlegen ist (Biomaterials 2013, 24:5926-36). Da BB-1 im Vergleich zur BMP-2 Behandlung eine erhöhte Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Sekretion induzierte, war es naheliegend, dass BB-1 pro-angiogene Eigenschaften von GDF-5 mit verbesserten osteogenen Eigenschaften vereint. Ziel der vorliegenden Studie war die quantitative Untersuchung der Neoangiogenese im Tiermodell zu frühen Zeitpunkten nach Behandlung mit BMP-2, GDF-5 und BB-1.
Methodik: Am Radius von Kaninchen (n=44) wurde ein 15 mm langer Knochendefekt gesetzt, in den ein Kollagenschwamm mit 50 μg BMP-2, GDF-5 oder einer GDF-5 Mutante (BB-1) eingebracht wurde. Kontrolltiere erhielten nur den Träger. Nach 7 und 14 Tagen Standzeit erfolgte die Auswertung der Knochenneubildung mittels in vivo μ-CT sowie, nach in vivo Perfusion der Gefäße mit Kontrastmittel, anschließender Knochenexplantation und Dekalzifizierung eine ex vivo μ-CT Angiographie.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Vorgehensweise ermöglichte die Visualisierung und Quantifizierung der Vaskularisierung in hoher Auflösung. Sieben Tage nach Wachstumsfaktor-Applikation zeigten nur die mit BB-1 und GDF-5 behandelten Defekte eine signifikant höhere Neoangiogenese gegenüber Kontrolltieren. Am Tag 14 wurde diese für alle Wachstumsfaktoren deutlich. Die kumulative Auswertung erbrachte für das Gefäßvolumen einen signifikanten Vorteil von GDF-5 (3,8-fach, p=0,049) sowie BB-1 (3,9-fach, P=0,007) gegenüber BMP-2. Jeder der Wachstumsfaktoren zeigte nach 14 Tagen signifikant mehr neues Knochenvolumen gegenüber der Kontrollgruppe (p<0,01). Die durch BB-1 induzierte Knochenneubildung war signifikant erhöht gegenüber GDF-5 (p<0,01).
Zusammengefasst stimulierten die Wachstumsfaktoren nachhaltig die Neoangiogenese während der Knochenneubildung. Im Vergleich zu BMP-2 wird dieser Effekt bei BB-1 und GDF-5 früher deutlich. Nur BB-1 verbindet die Vorteile einer frühen Neoangiogenese mit einer ausgeprägten Stimulation der Osteogenese die in einer besseren Knochenarchitektur resultiert. Aus diesem Grund stellt die Applikation von BB-1 einen vielversprechenden Ansatz zur Heilung von Röhrenknochendefekten kritischer Größe dar.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR12-704
doi: 10.3205/14dkou479, urn:nbn:de:0183-14dkou4797
Published: October 13, 2014
© 2014 Kleinschmidt et al.
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by G. H. | Nov 20, 2018 | Arthrosetherapie, News
Optimierung der Wachstumsfaktortherapie von großen Knochendefekten
Schwarz C, Willie B, Ellinghaus A, Lienau J, Seemann P, Duda GN
Fragestellung: Rekombinante BMPs sind, neben dem Goldstandard autologes Knochentransplantat, klinisch zur Behandlung kritischer Knochendefekte im Einsatz. Ihre Anwendung in überhöhten Konzentrationen kann zu erheblichen Nebeneffekten führen, die eine kritische Diskussion des Einsatzes von BMPs nach sich gezogen haben [1]. Wünschenswert wären somit Therapieoptionen, die bei geringerer Konzentration bereits effektive Heilungsergebnisse erlauben. Ziel war es, zum einen mögliche Alternativen zu rhBMP2 und rhBMP7, zum anderen den Einsatz geringerer Konzentrationen zur erfolgreichen Knochendefektheilung zu testen. Wir untersuchten GDF5 und eine GDF5-Variante mit erhöhter biologischer Aktivität aufgrund einer Noggin-Resistenz im Vergleich zu BMP2 als Stimuli für die Knochendefektheilung.
Methodik: Weiblichen SD-Ratten wurde ein standardisierter, nicht-heilender Defekt am linken Femur gesetzt und mit einem externen Fixateur stabilisiert. Die Tiere erhielten zur Defektregeneration eine niedrige Konzentration (5 µg) an rhBMP2, rhGDF5 und der rhGDF5-Variante. Die Stimuli wurden mit Hilfe eines Kollagenschwammes (Lyostypt) im kritischen Defekt platziert. Ein Kollagenschwamm mit Pufferlösung wurde in der Kontrollgruppe eingesetzt. Der Defektbereich wurde mittels in vivo MicroCT nach zwei, vier und sechs Wochen sowie histologisch und histomorphometrisch nach sechs Wochen post-OP analysiert. Die Ergebnisse wurden mit Daten einer Studie verglichen, in welcher die hier untersuchten Wachstumsfaktoren (BMP2, GDF5, GDF5-Variante) mit einer zehnfach höheren Dosis im kritischen Defektmodell appliziert wurden.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: BMP2 führte bereits nach 2 Wochen sowohl mit der geringen als auch der zehnfach höheren Dosis zu einem komplett überbrückten Defekt, wobei das Kallusvolumen in der Gruppe der niedrigen Dosis reduziert war. Nach Applikation der GDF5-Variante kam es sowohl mit der geringen (in Woche 2) als auch mit der hohen Konzentration (in Woche 4) zu einer Defektüberbrückung. Zudem war eine vergleichbare Knochenmenge gegenüber BMP2 zum 6 Wochen-Zeitpunkt zu verzeichnen. Bei GDF5 zeigte bereits die geringere Dosis eine vollständige Überbrückung zum 4 Wochen-Zeitpunkt, während bei der zehnfach höheren Dosis nach 4 Wochen eine beginnende endostale Heilung sichtbar wurde.
Auch bei der geringen Dosis zeigen GDF5 und ihre Variante vergleichbar zu BMP2 einen vollständig knöchern überbrückten Defekt. Beide Stimuli stellen somit potentielle Kandidaten zur Behandlung kritischer Defekte in Röhrenknochen dar. Es zeigte sich eine unerwartete Dosis-Abhängigkeit der Wachstumsfaktoren, die bei GDF5 in geringerer Dosis zu einer wesentlich besseren Heilung führte. Die Studie zeigt deutlich das Potential alternativer Stimuli, die auch in sehr viel geringeren Dosen einen Heilungseffekt aufweisen können.
Literatur:
1. Axelrad TW, Einhorn TA. Bone Morphogenetic Proteins in Orthopaedic Surgery. Cytokine Growth Factor Rev. 2009;20(5-6):481-8.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR12-1163
doi: 10.3205/14dkou478, urn:nbn:de:0183-14dkou4783
Published: October 13, 2014
© 2014 Schwarz et al.
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by G. H. | Nov 20, 2018 | Anti Aging, Arthrosetherapie, News
BMP9: Eine potentere Alternative zu BMP2 und BMP7 für die klinische Anwendung?
Ehnert S, Freude T, Lacorte P, Schröter S, Ochs G, Nussler A
Fragestellung: Bone morphogenetic proteins (BMPs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Proliferation und Reifung von Osteoblasten. Seit einigen Jahren werden BMP-2 und BMP-7 klinisch angewendet. Trotz der nachgewiesenen positiven Effekten dieser rekombinanten humanen (rh)BMPs bei der Behandlung von Pseudarthrosen, ist die Anwendung mit hohen Kosten verbunden. Darüber hinaus existieren Berichte über Komplikationen (vertebrale Osteolyse, Radikulopathie, Weichteilschwellung) und hohe Ausfallraten. Adenovirale Überexpression verschiedener BMPs zeigte, dass BMP9 eines der potentesten osteogenen BMPs ist. Allerdings konnte BMP9 lange nicht als rekombinantes Protein hergestellt werden, wodurch wenig über dessen direkte biologische Funktion bekannt ist. Ziel dieser Arbeit ist es deshalb, die osteogenen Effekte von rhBMP9, im Vergleich zu rhBMP2 und rhBMP7, auf humane Osteoblasten zu untersuchen.
Methodik: Primäre humane Osteoblasten wurden durch Kollagenaseverdau aus Spongiosa von Patienten gewonnen (Ethikgenehmigung 364/2012BO2). Als Kontrolle dienten murine prämyoblastische Vorläuferzellen (C2C12 Zellen). Die Zellen wurden mit rhBMP2, rhBMP7 oder rhBMP9 stimuliert. Als funktionelle Parameter wurden Viabilität/Proliferation, Alkalische Phosphatase (AP) Aktivität sowie Bildung mineralisierter Matrix (von Kossa und Alizarin Rot Färbung) bestimmt. Genexpressionsänderungen wurden mittels RT-PCR bestimmt. Die Ergebnisse der Gruppen wurden mittels ANOVA verglichen.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Im Durchschnitt induzieren alle drei eingesetzten rhBMPs die Proliferation oder AP-Aktivität der primären humanen Osteoblasten. In beiden Fällen wird dadurch mehr Phosphat für die Bildung Mineralisierter Matrix bereitgestellt. Interessanterweise, mussten von rhBMP9 (5-10 ng/ml) weit weniger Protein eingesetzt werden um vergleichbare Ergebnisse zu rhBMP2 (50-100 ng/ml) und rhBMP7 (50-100 ng/ml) zu erreichen. Allerdings entspricht die Ausfallrate den klinischen Berichten und es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den 3 untersuchten rhBMPs ermittelt werden. Die Ausfallrate scheint indirekt im Zusammenhang mit die Aktivierung (kanonisch und nicht-kanonisch) des Wnt Signalweges zu stehen, da es in der Respondergruppe signifikante Unterschiede in der Genexpression der bekannten Wnt Inhibitoren SOST, DKK1 und DKK2 gibt. Dies wird bestätigt durch Versuche mit C2C12 Zellen, in welchen der Zellkulturüberstand der Osteoblasten die Effekte von rhBMP9 neutralisierte.
Zusammenfassend, bestätigen unsere Ergebnisse die Annahme, dass rhBMP9 eine potentere Alternative zu rhBMP2 und rhBMP7 darstellt, da für vergleichbare Effekte nur ca. 1/10 des rekombinanten Proteins benötigt wurde. Allerdings zeigte rhBMP9 in vitro dieselbe Ausfallrate wie rhBMP2 und rhBMP7. Bedingt durch die Regulation der Wnt Inhibitoren SOST, DKK1 und DKK2 scheint die Ausfallrate indirekt im Zusammenhang mit der Aktivierung des Wnt Signalweges zu stehen. Durch die genaue Identifizierung dieser Mechanismen könnte die BMP Therapie weiter optimiert werden.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR12-1109
doi: 10.3205/14dkou477, urn:nbn:de:0183-14dkou4776
Published: October 13, 2014
© 2014 Ehnert et al.
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