by G. H. | Nov 20, 2018 | Arthrosetherapie, News
Erhöhtes angiogenes Potenzial von GDF-5 und einer GDF-5 Mutante gegenüber BMP-2 bei der Regeneration von Röhrenknochendefekten im Kaninchen
Kleinschmidt K, Wagner-Ecker M, Bartek B, Holschbach J, Rütze M, Richter W
Fragestellung: Die Verwendung von Knochenersatzmaterialien zur Applikation von Wachstumsfaktoren, vor allem aus der Familie der bone morphogenetic proteins (BMPs) hat sich für die Stimulation der Knochenneubildung bewährt. Die Nachverfolgung von Neoangiogenese im Heilungsverlauf beim Einsatz dieser Faktoren wird aber aufgrund der hohen Röntgendichte erschwert. In einer kürzlich veröffentlichten Studie konnte gezeigt werden, dass eine Mutante des pro-angiogenen Wachstumsfaktors growth/differentiation factor 5 (GDF-5) mit neu erworbener BMP1A-Rezeptor Affinität (BB-1) zu einer Stimulation der Knochenneubildung in langen Röhrenknochendefekten des Kaninchens führt, die dem klinischen Standard BMP-2 überlegen ist (Biomaterials 2013, 24:5926-36). Da BB-1 im Vergleich zur BMP-2 Behandlung eine erhöhte Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Sekretion induzierte, war es naheliegend, dass BB-1 pro-angiogene Eigenschaften von GDF-5 mit verbesserten osteogenen Eigenschaften vereint. Ziel der vorliegenden Studie war die quantitative Untersuchung der Neoangiogenese im Tiermodell zu frühen Zeitpunkten nach Behandlung mit BMP-2, GDF-5 und BB-1.
Methodik: Am Radius von Kaninchen (n=44) wurde ein 15 mm langer Knochendefekt gesetzt, in den ein Kollagenschwamm mit 50 μg BMP-2, GDF-5 oder einer GDF-5 Mutante (BB-1) eingebracht wurde. Kontrolltiere erhielten nur den Träger. Nach 7 und 14 Tagen Standzeit erfolgte die Auswertung der Knochenneubildung mittels in vivo μ-CT sowie, nach in vivo Perfusion der Gefäße mit Kontrastmittel, anschließender Knochenexplantation und Dekalzifizierung eine ex vivo μ-CT Angiographie.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Vorgehensweise ermöglichte die Visualisierung und Quantifizierung der Vaskularisierung in hoher Auflösung. Sieben Tage nach Wachstumsfaktor-Applikation zeigten nur die mit BB-1 und GDF-5 behandelten Defekte eine signifikant höhere Neoangiogenese gegenüber Kontrolltieren. Am Tag 14 wurde diese für alle Wachstumsfaktoren deutlich. Die kumulative Auswertung erbrachte für das Gefäßvolumen einen signifikanten Vorteil von GDF-5 (3,8-fach, p=0,049) sowie BB-1 (3,9-fach, P=0,007) gegenüber BMP-2. Jeder der Wachstumsfaktoren zeigte nach 14 Tagen signifikant mehr neues Knochenvolumen gegenüber der Kontrollgruppe (p<0,01). Die durch BB-1 induzierte Knochenneubildung war signifikant erhöht gegenüber GDF-5 (p<0,01).
Zusammengefasst stimulierten die Wachstumsfaktoren nachhaltig die Neoangiogenese während der Knochenneubildung. Im Vergleich zu BMP-2 wird dieser Effekt bei BB-1 und GDF-5 früher deutlich. Nur BB-1 verbindet die Vorteile einer frühen Neoangiogenese mit einer ausgeprägten Stimulation der Osteogenese die in einer besseren Knochenarchitektur resultiert. Aus diesem Grund stellt die Applikation von BB-1 einen vielversprechenden Ansatz zur Heilung von Röhrenknochendefekten kritischer Größe dar.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR12-704
doi: 10.3205/14dkou479, urn:nbn:de:0183-14dkou4797
Published: October 13, 2014
© 2014 Kleinschmidt et al.
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by G. H. | Nov 20, 2018 | Arthrosetherapie, News
Optimierung der Wachstumsfaktortherapie von großen Knochendefekten
Schwarz C, Willie B, Ellinghaus A, Lienau J, Seemann P, Duda GN
Fragestellung: Rekombinante BMPs sind, neben dem Goldstandard autologes Knochentransplantat, klinisch zur Behandlung kritischer Knochendefekte im Einsatz. Ihre Anwendung in überhöhten Konzentrationen kann zu erheblichen Nebeneffekten führen, die eine kritische Diskussion des Einsatzes von BMPs nach sich gezogen haben [1]. Wünschenswert wären somit Therapieoptionen, die bei geringerer Konzentration bereits effektive Heilungsergebnisse erlauben. Ziel war es, zum einen mögliche Alternativen zu rhBMP2 und rhBMP7, zum anderen den Einsatz geringerer Konzentrationen zur erfolgreichen Knochendefektheilung zu testen. Wir untersuchten GDF5 und eine GDF5-Variante mit erhöhter biologischer Aktivität aufgrund einer Noggin-Resistenz im Vergleich zu BMP2 als Stimuli für die Knochendefektheilung.
Methodik: Weiblichen SD-Ratten wurde ein standardisierter, nicht-heilender Defekt am linken Femur gesetzt und mit einem externen Fixateur stabilisiert. Die Tiere erhielten zur Defektregeneration eine niedrige Konzentration (5 µg) an rhBMP2, rhGDF5 und der rhGDF5-Variante. Die Stimuli wurden mit Hilfe eines Kollagenschwammes (Lyostypt) im kritischen Defekt platziert. Ein Kollagenschwamm mit Pufferlösung wurde in der Kontrollgruppe eingesetzt. Der Defektbereich wurde mittels in vivo MicroCT nach zwei, vier und sechs Wochen sowie histologisch und histomorphometrisch nach sechs Wochen post-OP analysiert. Die Ergebnisse wurden mit Daten einer Studie verglichen, in welcher die hier untersuchten Wachstumsfaktoren (BMP2, GDF5, GDF5-Variante) mit einer zehnfach höheren Dosis im kritischen Defektmodell appliziert wurden.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: BMP2 führte bereits nach 2 Wochen sowohl mit der geringen als auch der zehnfach höheren Dosis zu einem komplett überbrückten Defekt, wobei das Kallusvolumen in der Gruppe der niedrigen Dosis reduziert war. Nach Applikation der GDF5-Variante kam es sowohl mit der geringen (in Woche 2) als auch mit der hohen Konzentration (in Woche 4) zu einer Defektüberbrückung. Zudem war eine vergleichbare Knochenmenge gegenüber BMP2 zum 6 Wochen-Zeitpunkt zu verzeichnen. Bei GDF5 zeigte bereits die geringere Dosis eine vollständige Überbrückung zum 4 Wochen-Zeitpunkt, während bei der zehnfach höheren Dosis nach 4 Wochen eine beginnende endostale Heilung sichtbar wurde.
Auch bei der geringen Dosis zeigen GDF5 und ihre Variante vergleichbar zu BMP2 einen vollständig knöchern überbrückten Defekt. Beide Stimuli stellen somit potentielle Kandidaten zur Behandlung kritischer Defekte in Röhrenknochen dar. Es zeigte sich eine unerwartete Dosis-Abhängigkeit der Wachstumsfaktoren, die bei GDF5 in geringerer Dosis zu einer wesentlich besseren Heilung führte. Die Studie zeigt deutlich das Potential alternativer Stimuli, die auch in sehr viel geringeren Dosen einen Heilungseffekt aufweisen können.
Literatur:
1. Axelrad TW, Einhorn TA. Bone Morphogenetic Proteins in Orthopaedic Surgery. Cytokine Growth Factor Rev. 2009;20(5-6):481-8.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR12-1163
doi: 10.3205/14dkou478, urn:nbn:de:0183-14dkou4783
Published: October 13, 2014
© 2014 Schwarz et al.
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by G. H. | Nov 20, 2018 | Anti Aging, Arthrosetherapie, News
BMP9: Eine potentere Alternative zu BMP2 und BMP7 für die klinische Anwendung?
Ehnert S, Freude T, Lacorte P, Schröter S, Ochs G, Nussler A
Fragestellung: Bone morphogenetic proteins (BMPs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Proliferation und Reifung von Osteoblasten. Seit einigen Jahren werden BMP-2 und BMP-7 klinisch angewendet. Trotz der nachgewiesenen positiven Effekten dieser rekombinanten humanen (rh)BMPs bei der Behandlung von Pseudarthrosen, ist die Anwendung mit hohen Kosten verbunden. Darüber hinaus existieren Berichte über Komplikationen (vertebrale Osteolyse, Radikulopathie, Weichteilschwellung) und hohe Ausfallraten. Adenovirale Überexpression verschiedener BMPs zeigte, dass BMP9 eines der potentesten osteogenen BMPs ist. Allerdings konnte BMP9 lange nicht als rekombinantes Protein hergestellt werden, wodurch wenig über dessen direkte biologische Funktion bekannt ist. Ziel dieser Arbeit ist es deshalb, die osteogenen Effekte von rhBMP9, im Vergleich zu rhBMP2 und rhBMP7, auf humane Osteoblasten zu untersuchen.
Methodik: Primäre humane Osteoblasten wurden durch Kollagenaseverdau aus Spongiosa von Patienten gewonnen (Ethikgenehmigung 364/2012BO2). Als Kontrolle dienten murine prämyoblastische Vorläuferzellen (C2C12 Zellen). Die Zellen wurden mit rhBMP2, rhBMP7 oder rhBMP9 stimuliert. Als funktionelle Parameter wurden Viabilität/Proliferation, Alkalische Phosphatase (AP) Aktivität sowie Bildung mineralisierter Matrix (von Kossa und Alizarin Rot Färbung) bestimmt. Genexpressionsänderungen wurden mittels RT-PCR bestimmt. Die Ergebnisse der Gruppen wurden mittels ANOVA verglichen.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Im Durchschnitt induzieren alle drei eingesetzten rhBMPs die Proliferation oder AP-Aktivität der primären humanen Osteoblasten. In beiden Fällen wird dadurch mehr Phosphat für die Bildung Mineralisierter Matrix bereitgestellt. Interessanterweise, mussten von rhBMP9 (5-10 ng/ml) weit weniger Protein eingesetzt werden um vergleichbare Ergebnisse zu rhBMP2 (50-100 ng/ml) und rhBMP7 (50-100 ng/ml) zu erreichen. Allerdings entspricht die Ausfallrate den klinischen Berichten und es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den 3 untersuchten rhBMPs ermittelt werden. Die Ausfallrate scheint indirekt im Zusammenhang mit die Aktivierung (kanonisch und nicht-kanonisch) des Wnt Signalweges zu stehen, da es in der Respondergruppe signifikante Unterschiede in der Genexpression der bekannten Wnt Inhibitoren SOST, DKK1 und DKK2 gibt. Dies wird bestätigt durch Versuche mit C2C12 Zellen, in welchen der Zellkulturüberstand der Osteoblasten die Effekte von rhBMP9 neutralisierte.
Zusammenfassend, bestätigen unsere Ergebnisse die Annahme, dass rhBMP9 eine potentere Alternative zu rhBMP2 und rhBMP7 darstellt, da für vergleichbare Effekte nur ca. 1/10 des rekombinanten Proteins benötigt wurde. Allerdings zeigte rhBMP9 in vitro dieselbe Ausfallrate wie rhBMP2 und rhBMP7. Bedingt durch die Regulation der Wnt Inhibitoren SOST, DKK1 und DKK2 scheint die Ausfallrate indirekt im Zusammenhang mit der Aktivierung des Wnt Signalweges zu stehen. Durch die genaue Identifizierung dieser Mechanismen könnte die BMP Therapie weiter optimiert werden.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR12-1109
doi: 10.3205/14dkou477, urn:nbn:de:0183-14dkou4776
Published: October 13, 2014
© 2014 Ehnert et al.
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by G. H. | Nov 12, 2018 | Anti Aging, News, Rheumatologie + Osteoporose
Stimulation der Knochenheilung durch eine zeitlich verzögerte Freisetzung von Bone-morphogenetic-protein-2 (BMP-2) aus einer Implantatbeschichtung
Faßbender M, Strobel C, Minkwitz S, Schmidmaier G, Wildemann B
Fragestellung: Die Frakturheilung ist durch eine zeitlich koordinierte Zellaktivität gekennzeichnet und BMP-2 stellt einen der wichtigsten regulierenden Faktoren dar. Die BMP-2 Expression im Heilungsverlauf wird früh induziert, allerdings erfolgt eine weitere Erhöhung während der späteren Osteogenese. Es gibt Hinweise, dass eine spätere Applikation effektiver für die Stimulation der Heilung sein kann. In dieser Studie wurde der Effekt der verzögerten BMP-2 Gabe aus einer Implantat-Beschichtung im Modell mit beeinträchtigter Knochenheilung [1] untersucht.
Methodik: Titan-Kirschner-Drähte wurden mit Poly(D,L-Laktid) (PDLLA) sowie BMP-2 (2.5% w/w in PDLLA) beschichtet. Die in-vitro Elution zeigte eine langsam ansteigende Freisetzung des inkorporierten BMP-2 bis Tag 35. Bei Ratten wurde die Tibia osteotomiert und mit PDLLA- (Kontrolle) oder mit PDLLA/BMP-2-beschichteten Drähten stabilisiert. Die Heilung wurde computertomographisch, histologisch und biomechanisch verfolgt (Tag 10, 28, 42 und 84 post-operativ; n=4-9 Tiere je Gruppe/Methode/Zeitpunkt). Statistik: Mann-Whitney Test.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Computertomographie zeigte eine gesteigerte Bildung von mineralisiertem Kallus sowie ein beschleunigtes Remodelling in der BMP-2 Gruppe mit einem signifikanten erhöhten Verhältnis Knochen-/Gesamtkallus-Volumen (p=0,02) am Tag 42. Histologisch war am Tag 10 die Kallusfläche beider Gruppen identisch; allerdings zeigte sich eine Gefäßreduktion (p=0,004) in der BMP-2 Gruppe. Die histologische Auswertung an den Tagen 28 – 84 ergab keine Unterschiede in der Kallusgröße jedoch eine in der BMP-2 Gruppe signifikant erhöhte Mineralisierung am Tag 42 und 84 (p=0,04). Die biomechanische Steifigkeit der osteotomierten Tibia war im Vergleich zu intakten Seite in der BMP-2 Gruppe zu allen Zeitpunkten gegenüber der Kontrolle erhöht mit signifikanten Unterschieden am Tag 42 (p=0,05).
Zusammenfassend zeigte sich ein verbesserter Heilungsverlaufes bei verzögerter BMP-2 Applikation gegenüber der Kontrolle. In einer früheren Studie war eine Beschichtung gewählt worden, die ca. 50% des Wachstumsfaktors innerhalb der ersten 48 h freisetzt [2]. Die Gefäßdichte war dort gegenüber der Kontrolle ebenfalls reduziert, allerdings im Vergleich zur aktuellen Studie noch deutlich erhöht. Bei initialer BMP-2 Freisetzung zeigten sich signifikante Unterschiede in der Mineralisation am Tag 42 sowie in der Steifigkeit bereits am Tag 28 und 42 im Vergleich zur Kontrolle. Auch wenn die verzögerte Freisetzung bezüglich des letztendlichen Heilungserfolges keine Überlegenheit ergibt, kann vermutet werden, dass die zeitliche Änderung des Auftretens signifikanter Unterschiede die verzögerte Freigabe widerspiegelt. Insofern kann diese Studie als Basis zur Adaptierung von Freisetzungsmustern entsprechend der physiologischen Sensitivität von Zellen und Geweben dienen.
Literatur
1. Kratzel C, Bergmann C, Duda G, Greiner S, Schmidmaier G, Wildemann B. Characterization of a rat osteotomy model with impaired healing. BMC Musculoskelet Disord. 2008;9:135. DOI: 10.1186/1471-2474-9-135 External link
2. Wildemann B, Lange K, Strobel C, Fassbender M, Willie B, Schmidmaier G. Local BMP-2 application can rescue the delayed osteotomy healing in a rat model. Injury. 2011 Aug;42(8):746-52. DOI: 10.1016/j.injury.2010.11.012
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR12-368
doi: 10.3205/14dkou476, urn:nbn:de:0183-14dkou4761
Published: October 13, 2014
© 2014 Faßbender et al.
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by G. H. | Nov 12, 2018 | News, Rheumatologie + Osteoporose
Ganzkörpervibration (LMHFV) führt zu einer Beeinträchtigung der Frakturheilung in alten Mäusen, aber verbessert die Frakturheilung in alten, ovarektomierten Mäusen
Wehrle E, Fischer L, Bindl R, Heilmann A, Wehner T, Jakob F, Amling M, Ignatius A
Fragestellung: Ein möglicher therapeutischer Ansatz zur Verbesserung der gestörten Frakturheilung bei alten und osteoporotischen Individuen stellt die gezielte Applikation mechanischer Stimuli während der Frakturheilungszeit dar, z.B. die sog. low-magnitude high-frequency Vibration (LMHFV; Rubin et al. 2004). LMHFV wirkt im intakten und osteoporotischen Knochen anabol (Slatkovska et al. 2010), wohingegen die wenigen bis jetzt durchgeführten präklinischen Frakturheilungsstudien widersprüchliche Ergebnisse ergaben (Leung et al. 2009; Stuermer et al. 2010). Ziel dieser Studie war es daher, den Einfluss von LMHFV auf die Frakturheilung bei alten und ovarektomierten C57BL/6 Mäusen zu untersuchen.
Methodik: Weibliche C57BL/6NCrl Mäuse (n=56) wurden mit 41 Wochen ovarektomiert (OVX) oder Sham-operiert, bevor sie 8 Wochen später eine Femurosteotomie erhielten, die mit einem Fixateur externe stabilisiert wurde. Ab dem 3. postoperativen Tag erhielten die Tiere eine mechanische Interventionstherapie (20 min/d; 5d/Woche), wozu sie auf Vibrationsplattformen gesetzt wurden (Sham/OVX vibriert: f=45 Hz, a peak-to-peak=0,3 g je n=14). Nach 10 und 21 Tagen wurden die Tiere getötet und die Femora biomechanisch, mikro-computertomographisch und histologisch analysiert.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: OVX führte zu einer signifikant verschlechterten Frakturheilung mit Abnahme der biomechanischen und strukturellen Kalluseigenschaften im Vergleich zu nicht-ovarektomierten Tieren (Biegesteifigkeit: 46 vs. 901 Nmm2; µCT: BV/TV: 2 vs. 23%; Histomorphometrie: Knochenanteil im Kallus: 7 vs. 44%). Durch die Applikation von LMHFV konnte diese beeinträchtigte Frakturheilung signifikant verbessert werden (Biegesteifigkeit: 689 vs. 47 Nmm2; BV/TV: 36 vs. 9%; Knochenanteil im Kallus: 49 vs. 7%). Demgegenüber führte LMHFV in nicht ovarektomierten Tieren gleichen Alters zu einer signifikant verschlechterten Frakturheilung (Biegesteifigkeit: 174 vs. 901 Nmm2; BV/TV: 16 vs. 47%; Knochenanteil im Kallus: 14 vs. 44%). Die Vibration bewirkte unterschiedliche Effekte auf die Frakturheilung in Abhängigkeit von OVX. Während LMHFV den gestörten Frakturheilungsprozess bei den alten OVX Tieren signifikant verbesserte, führte die Vibration bei gleichaltrigen nicht ovarektomierten Tieren zu einer signifikant verschlechterten Frakturheilung. Dies deutet auf eine mögliche entscheidende Rolle von Östrogen für die Mechanobiologie der Frakturheilung hin. Die vorliegende Studie zeigt ein therapeutisches Potential von LMHFV für die osteoporotische Frakturheilung auf. Aufgrund der beobachteten gegensätzlichen Effekte von LMHFV auf die Frakturheilung in Abhängigkeit von OVX sollten mögliche klinische Anwendungen jedoch kritisch geprüft werden.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR12-724
doi: 10.3205/14dkou475, urn:nbn:de:0183-14dkou4754
Published: October 13, 2014
© 2014 Wehrle et al.
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