by R-Dorotka | Apr 3, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
Intracellular proliferation of S. aureus in osteoblasts and effects of rifampicin and gentamicin on S. aureus intracellular proliferation and survival
Mohamed W, Sommer U, Domann E, Schnettler R, Alt V
Objective: Staphylococcus aureus is the most frequent causal agent for bone infection. When S. aureus infection affects a total joint arthroplasty, removal and replacement of joint is mostly required. Moreover, it was recently discovered that S. aureus is able to invade osteoblasts thus escaping the extracellular host antibacterial defense and even antibiotics. This plays a significant role in persistence and recurrence of infection. The aim of this study was to investigate whether (1) S. aureus is able to not only invade but also proliferate within osteoblasts, (2) the mechanism of invasion and (3) to clarify whether rifampicin or gentamicin can inhibit intracellular proliferation and survival of S. aureus.
Method: SAOS-2 osteoblast-like cell line were grown in Minimum Essential Medium and subsequently infected with S. aureus EDCC5055 and S. aureus Rosenbach 1884 (ATCC 12598). In order to test the mode of bacterial internalization, SAOS-2 cells were treated 2h prior to infection with cytochalasin D which is the major actin depolymerization agent disrupting actin microfilaments. Immunofluorescence and transmission electromicroscopic (TEM) imaging were performed to detect potential intracellular and proliferating bacteria. For antibiotic experiments, SAOS-2 osteoblasts infected with S. aureus were treated with 7.5 microgram/ml of rifampicin or 30 microgram/ml, 100 microgram/ml, or 200 microgram/ml of gentamicin for 4h and 24h.
Results and conclusion: Both S. aureus strains were able to efficiently invade and to proliferate within human osteoblasts shown by typical bacterial growth curves. Immunofluorescence microscopy showed intracellular invasion of S. aureus and TEM images could demonstrate bacterial division as well as disruption of lysosomal membranes as a sign of successful intracellular proliferation and survival. Cytochalasin D was able to significantly reduce S. aureus invasion ability suggesting that invasion was enabled by promoting actin rearrangement at the cell surface. 7.5 microgram/ml of rifampicin was able to inhibit bacterial survival in human osteoblasts with almost complete elimination of bacteria after 4 h. Effects of gentamicin were dose-dependent but even high doses with 200 microgram/ml of gentamicin were associated with a statistically significant higher number of survived bacteria compared to rifampicin. In conclusion, S. aureus is not only able to invade but also to proliferate in osteoblasts. Invasion seems to be associated with actin rearrangement at the cell surface. Rifampicin is effective in intracellular eradication of S. aureus whereas gentamicin seems to have a much weaker intracellular effect. Based on these data, doses of rifampicin and gentamicin could be optimized for local use to coat end prostheses and be able to reach the intracellular compartments thus killing the probable intracellular persisting S. aureus without causing undesirable systemic side effects.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-1222
doi: 10.3205/14dkou524, urn:nbn:de:0183-14dkou5245
Published: October 13, 2014
© 2014 Mohamed et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by R-Dorotka | Apr 3, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
In-vitro Studie zur individuellen lokalen Freisetzung verschiedener Antibiotika gegen bakterielle Erreger einsatzbedingter Osteomyelitiden
Back DA, Calafi A, Bormann N, Garbe LA, Schmidmaier G, Willy C, Wildemann B
Fragestellung: Die häufigsten Verwundungen von Soldaten in Afghanistan betreffen das muskuloskeletale System. Zur Verhinderung von Osteomyelitiden ist ein chirurgisches Debridement mit additiver systemischer Antibiotikagabe das Mittel der ersten Wahl. Dieses Konzept könnte durch eine zusätzliche lokale Antibiotikafreisetzung von Implantaten ergänzt werden. Diese in-vitro Studie sollte die Möglichkeiten einer bestehenden Implantatbeschichtung erforschen, unterschiedliche Antibiotika einzeln oder in Mehrfachbeschichtung wirkungsvoll gegen einsatzrelevante Osteomyelitiserreger freizusetzen.
Methodik: Titan-Kirschner-Drähte wurden mit Poly(D,L-Laktid) (PDLLA) und verschiedenen Antibiotika (Abx)-Konzentrationen (3 pro Abx) Ciprofloxacin, Gentamicin, Colistin, Daptomycin und Cefoxitin beschichtet, bei 37°C in NaCl eluiert und nach 4 h, 1, 3, 7, 14, 28 und 42 Tagen Proben entnommen (n=6). Mit den Eluaten wurde eine Hemmhofbestimmung nach Kirby-Bauer gegen gram-positive (Staph. aureus, MRSA) oder gram-negative (Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa) Bakterienstämme durchgeführt. Die Abx-Konzentrationen in den effektivsten Elutionsreihen wurden mittels Massenspektrometrie oder KIMS-Verfahren quantifiziert. In einem weiteren Ansatz wurden Doppelbeschichtungen mit Gentamicin und Colistin (n=6) gegen eine simulierte Mischinfektion mit Staph. aureus und einem multiresistenten A. baumannii getestet. Um toxische Effekte auf Knochenzellen auszuschließen, wurden Osteoblasten mit den verschiedenen Konzentrationen der jeweiligen Abx kultiviert. Die metabolische Aktivität und die alkalische Phosphatase wurden nach 3 Tagen gemessen.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Als Beschichtungskonzentrationen mit den effektivsten bakterienhemmenden Eigenschaften wurden 10% w/w für Gentamicin, Colistin und Ciprofloxacin, sowie 40% w/w für Daptomycin identifiziert. Außer Daptomycin zeigten alle Abx einen initialen Burst-release mit kontinuierlicher Freisetzung über 42 Tage. Daptomycin wies eine gesteigerte Freisetzung innerhalb der ersten 24h auf. Cefoxitin führte in keiner Beschichtungs-Konzentration zu einem inhibitorischen mikrobiologischen Effekt und war auch in der Freisetzungskinetik nur gering nachweisbar. Die Doppelbeschichtung mit Gentamicin und Colistin führte zu einer effektiven Freisetzung beider Antibiotika mit nachweisbarer Bakterienhemmung. Keine der Konzentrationen zeigte einen inhibitorischen Effekt auf Osteoblasten in-vitro.
Diese Studie zeigt, dass die Möglichkeit besteht, mittels PDLLA Antibiotikabeschichtungen für Implantate herzustellen, die auch individuellen Keimspektren angepasst sind. Hierbei sind auch Doppel-Beschichtungen mit Antibiotika möglich. Bei den Implantatbeschichtungen ist das Mengenverhältnis eingearbeiteter Medikamente zu berücksichtigen, ferner bei der Freisetzungskinetik die Halbwertszeit der Antibiotika. Die Ergebnisse unterstützen eine weitere Erforschung der gewählten Beschichtungen zur Bekämpfung von Osteomyelitis-induzierenden einsatzrelevanten Bakterienstämmen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-1440
doi: 10.3205/14dkou523, urn:nbn:de:0183-14dkou5231
Published: October 13, 2014
© 2014 Back et al.
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by R-Dorotka | Apr 3, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
In vitro Untersuchung neuer Antibiotika-Kombinationen mit Calciumsulsphat zur lokalen Behandlung von Knochen- und Gelenksinfekten. Die nahezu konstante Freisetzung von Ceftriaxon bietet neue Behandlungsmöglichkeiten
Rönn K, Wahl P, Bohner M, Decosterd L, Festa S, Gautier E
Fragestellung: Antibiotika werden bei Knochen- und Gelenksinfekten lokal eingesetzt, um die Probleme einer schlechten Penetration zu umgehen und das Risiko einer Organtoxizität bei systemischer Verabreichung zu vermeiden. Zusätzlich kann die Trägersubstanz dazu beitragen, postoperativen Totraum zu füllen. Klassisch lokal eingesetze Aminoglykoside wie Gentamicin oder Glykopeptide wie Vancomycin erlauben aber nicht alle Infekte adäquat abzudecken. Die Standart-Trägersubstanz ist bis heute PMMA-Zement, wodurch zusätzliche Operationen zur Entfernung nötig werden. Ausserdem wird das Antibiotikum nur zu Beginn in therapeutischen Dosen freigesetzt. Als bessere Substanz bietet sich Calciumsulphat (CaSO4) an. Es ist mit verschiedenen Antibiotika kompatibel, löst sich über die Zeit auf und kann resorbiert werden. Das Ziel dieser Studie war es, neue Kombinationen von Calciumsulphat mit verschiedenen Antibiotika, deren Freisetzung über die Zeit, antimikrobielle Aktivität sowie Stabilität in vitro zu bestimmen.
Methodik: Antibiotika-CaSO4-Kugeln wurden gemäss bekannter Methoden hergestellt. Das Verhältnis des Antibiotikums zum CaSO4-Hemihydratpulvers war 8%, die Zugabe von demineralisiertem Wasser erfolgte gemäss Bedarf, um das Material verarbeiten zu können. Überschüssiges Wasser wurde durch Dessikation vor dem Elutionsexperiment entfernt. Die gewählten Antibiotika waren Flucloxacillin, Piperaccillin/Tazobactam, Cefuroxim, Ceftriaxon, Ceftazidim, Cefepim, Meropenem, Ciprofloxacin, Levofloxacin und Clindamycin. Das Elutionsexperiment erfolgte über 6 Wochen, zuerst in PBS-Lösung, anschliessend in Rinderplasma, was mit Enoxaparin antikoaguliert wurde. Die Bestimmung der Antibiotikakonzentration erfolgte mit LC-MS/MS in regelmässigen Abständen aus der täglich gewechselten Elutionsflüssigkeit. Diese Chromatographieresultate wurden durch Agardiffusionstests bestätigt, je nach Antibiotikaspektrum mit S.aureus ATCC 25922 oder E. coli ATCC 35218.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Piperacillin-Tazobactam, Ceftazidim, Cefepim sowie Meronem zeigten eine rasche Reduktion der Konzentration sowie der Aktivität. Flucloxacillin und Cefuroxim blieben in klinisch relevanten Konzentrationen über 4 Wochen präsent. Ciprofloxacin und Levofloxacin sogar für 6 Wochen, wenn auch in zunehmend abnehmenden Konzentrationen. Diese liegen anfangs aber in einem Bereich, wo lokale Zelltoxizität zu erwarten ist. Flucloxacillin, Cefuroxim sowie Clindamycin könnten klinischen Einsatz finden, vor allem, wenn eine begrenzte Wirkungsdauer von Tagen bis Wochen erwünscht ist.
Herausstechend zeigte sich Ceftriaxon, wo eine nur leichte Abnahme der Konzentration von ca. 130 mg/l auf ca. 75 mg/l über 6 Wochen erfolgte, bei einer anhaltend hohen antimikrobiellen Aktivität.
Dieses Experiment eröffnet neue Möglichkeiten zum lokalen Einsatz von Antibiotika mit CaSO4 als resorbierbare Trägersubstanz. Insbesondere ist die fast konstante Freisetzung von Ceftriaxon von grossem Interesse, da hohe Konzentrationen über 6 Wochen beobachtet wurden.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-268
doi: 10.3205/14dkou522, urn:nbn:de:0183-14dkou5224
Published: October 13, 2014
© 2014 Rönn et al.
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by G. H. | Mrz 25, 2019 | Konservative Orthopädie, News
SDF1 induziertes Homing von adipose derived stem cells (ASC) in der Wundheilung
Koenen P, Lipensky A, Thamm O, Bouillon B, Fuchs P, Neugebauer EAM, Stürmer EK
Fragestellung: Die Prävalenz chronischer Wunden nimmt aufgrund der demographischen Entwicklung in industrialisierten Ländern stetig zu. Einer der pathophysiologischen Mechanismen ist das gestörte Homing von Stammzellen zur Wunde. In diesem Projekt sollten der SDF1/CXCR4-Pathway, für den in hämatopoetischen Progenitorzellen bereits ein migratorischer Einfluss nachgewiesen wurde, sowie der neuere SDF1/CXCR7-Pathway in ASC fokussiert werden.
Methodik: Humane ASC wurden in vitro mit Wundsekret akuter (AWF) und chronischer (CWF) Wunden inkubiert. Mittels Transwell-Migrationsassay und qRT-PCR wurden die ASC-Migration sowie die Expression verschiedener migrationsstimulierender und migrationshemmender Faktoren analysiert. Die Experimente wurden außerdem nach Präinkubation mit den Rezeptorantagonisten für CXCR4 und CXCR7 durchgeführt. Mittels ELISA wurde SDF1 sowohl in verschiedenen AWF- und CWF-Proben als auch im ASC-Überstand quantifiziert. Um interindividuelle Unterschiede zu analysieren, wurden die Versuche mit ASC von sieben humanen Donoren durchgeführt.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die ASC zeigten immunzytochemisch eine Expression der Oberflächenmarker CD73, CD90, und CD105 bei Negativität für CD45 und konnten in Adipozyten differenziert werden. Während in AWF eine durchschnittliche SDF1-Konzentration von 73.5 pg/ml nachgewiesen werden konnte, war die SDF-Konzentration in allen CWF-Proben unterhalb der Nachweisgrenze. Im ASC-Überstand war SDF1 nach AWF-Inkubation signifikant erhöht, in CWF hingegen signifikant erniedrigt (AWF: 129.7 pg/ml; CWF: 30 pg/ml; ctrl: 95.5 pg/ml). Die Migration von ASC war durch AWF verglichen mit der Kontrolle signifikant erhöht, dieser Effekt wurde vom CXCR4- und CXCR7-Antagonisten gemindert. CWF hatte keinen migrationsinduzierenden Effekt auf ASC und die Rezeptorantagonisten hatten keinen Effekt. Unterschiede in der basalen und AWF-induzierten Migrationskapazität konnten für die verschiedenen Donoren gezeigt werden. CXCR4, CXCR7 und SDF1 wurden in ASC nach AWF-Inkubation signifikant höher exprimiert, während die Expression von TIMP3 vermindert war. Die CXCR4/CXCR7-Antagonisten schwächten diesen Effekt ab.
In-vitro ist die ASC-Migration im chronischen Wundmilieu vermindert. Eine gestörte SDF1/CXCR4-, sowie SDF1/CXCR7-vermittelte Stammzellmigration scheint dabei eine wesentliche Rolle zu spielen und könnte so zumindest teilweise die verzögerte Heilung chronischer Wunden erklären. Außerdem konnte eine Donorspezifität der ASC-Migration in Abhängigkeit von individuellen Erkrankungen/Faktoren gezeigt werden.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-957
doi: 10.3205/14dkou521 , urn:nbn:de:0183-14dkou5211
Published: October 13, 2014
© 2014 Koenen et al.
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by G. H. | Mrz 25, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Molekulare Grundlagen der durch blaues Licht induzierten Differenzierungshemmung humaner Fibroblasten zu Myofibroblasten
Krassovka J, Suschek C, Windolf J
Fragestellung: Profibrotische Störungen, wie z.B. die Bildung von Keloiden oder hypertrophen Wundnarben basieren zumeist auf einer gestörten Regulation der Proliferation und/oder Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten. In früheren Studien konnten wir zeigen, dass Bestrahlung mit blauem Licht (453 und 474 nm) bereits in subletalen Dosen eine signifikante Erniedrigung der TGF-beta-induzierten Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten bewirkte. Der Untersuchungsschwerpunkt der aktuellen Studie war die Rolle des Flavin-haltigen Proteins NADPH-Oxidase 4 (NOX4), welches auf der Basis der Generierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) eine zentrale Schaltstelle des für die Fibroblastendifferenzierung essenziellen TGF-beta-Signalwegs darstellt.
Methodik: Verwendet wurden humane dermale Fibroblasten (FB) sowie Fibrosarkomzellen der Zelllinie HT1080. Bestrahlungen erfolgten unter Verwendung eines hochintensiven LED-Arrays (453 nm in subletalen Dosen von max. 80 J/cm2). Mit zellbiologischen Methoden (Immunproteinchemie) sowie molekularen Methoden (Western, RT-PCR) untersuchten wir die Photoeffekte der verwendeten Lichtquelle auf den molekularen Mechanismus der Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) wurden mittels Durchflusszytometrie und Fluorometrie detektiert. Als Parameter der NADPH-Oxidase-Aktivität haben wir photometrisch die Konzentrationen von NADP+ und NADPH quantifiziert.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: In Folge einer Differenzierungsinduktion von Fibroblasten mittels TGF-beta beobachteten wir eine leicht erhöhte intrazelluläre Produktion von ROS. Durch eine Bestrahlung der Zellen mit blauem Licht (max. 80 J/cm2) konnten wir eine wesentlich stärkere und über sechs Stunden anhaltende Erhöhung der intrazellulären ROS-Generierung beobachten. Diese starke Erhöhung der ROS-Produktion korrelierte zugleich mit einer mehr als 80%igen Hemmung der TGF-beta-abhängigen Fibroblastendifferenzierung. Die oben erwähnte intrazelluläre ROS-Produktion konnte aufgrund des langen Zeitintervalls nicht das primäre Ergebnis der Lichtexposition sein, sondern spiegelt vielmehr einen induzierten intrazellulären enzymatischen Prozess wider. Parallel zu der beschriebenen ROS-Produktion beobachteten wir in TGF-beta-aktivierten FB-Kulturen eine langandauernd erhöhte NOX4-Aktivität, wohingegen in den zusätzlich bestrahlten FB-Kulturen die NOX4-Aktivität über den beobachteten Zeitraum von sechs Stunden weit unter der Ausgangsaktivität lag. Da Flavinproteine, wie z.B. die NOX4, ein Absorptionsmaximum bei etwa 453 nm haben, postulieren wir hier einen Mechanismus, der eine Licht-induzierte Strukturveränderung des Flavin-haltigen Enzyms beinhaltet und dadurch zu einer Unterbrechung der TGF-beta-induzierten Differenzierungskaskade führt.
Durch die hier erwähnte lichtspektrumspezifische Modulation von Schlüsselenzymen der Fibroblastendifferenzierung sind wir in der Lage ein fibrotisches Ereignis effektiv, spezifisch sowie nebenwirkungs- und pharmafrei zu hemmen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-1341
doi: 10.3205/14dkou520 , urn:nbn:de:0183-14dkou5201
Published: October 13, 2014
© 2014 Krassovka et al.
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