by G. H. | Feb 19, 2019 | Konservative Orthopädie, News
rAAV-Vektoren können humane Knochenmarkaspirate in dynamischer und statischer Kultur stabil genetisch modifizieren
Venkatesan JK, Rey Rico A, Schmitt G, Kohn DM, Madry H, Cucchiarini M
Fragestellung: Knochenmarkaspirate können genetisch verändert werden und als Plattformen die Knorpelreparatur verbessern. Wir haben die Hypothese überprüft, dass rAAV-Vektoren humane Knochenmarkaspirate modifizieren können, um optimale Bedingungen für die Chondrogenese zu etablieren.
Methodik: Alle Transgene standen unter Kontrolle des CMV-IE Promotor/Enhancers: Beta-Galaktosidase ( β-gal) von E. coli (rAAV-lacZ), rot-fluoreszierendes-Protein Gen (RFP) von Discosoma sp. (rAAV-RPP) und Luciferase (luc) von Firefly (rAAV-luc). Knochenmarkaspirate wurden von Spendern, die sich einer Kniearthroplastik unterzogen hatten, gewonnen. Die Aspirate wurden in Kulturmedium gegeben und mit Vektoren transduziert. Die Proben wurden in statischer Kultur bzw. in dynamischen Rotationsbioreaktoren in definiertem chondrogenem Medium (bis zu 21 Tage) kultiviert. Transgenexpression wurde mittels X-Gal-Färbung, live Fluoreszenzmikroskopie und Luciferase-Aktivität bestimmt. Die transduktionseffiziens wurde mittels Paraffinschnitten histomorphometrisch bestimmt. Jede Kondition (N=3) wurde in drei unabhängigen Experimenten überprüft. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt.
Ergebnisse: Es gab keine sichtbaren Unterschiede zwischen den transduzierten und nichttransduzierten Aspiraten, weder im statischen noch im dynamischem System. Eine anhaltende, effiziente Transgenexpression (RFP, lacZ) wurde in den Aspiraten in der statischen wie auch in der dynamischen Kultur für einen Zeitraum von bis zu 21 Tagen beobachtet verglichen mit Kontrollkonditionen. Die beiden Systeme zeigten keine sichtbaren Unterschiede. Die Transduktionseffizienz am Tag 21 in diesen Systemen lag bei ~80–85% (versus <2% in den Kontrollen). Die Zelldichte nahm in der dynamischen Kultur im Vergleich zur statischen Kultur signifikant zu (8.072 ±105 versus 5.004 ±97 Zellen/mm2, P ≤ 0.001). Es wurde durch die luc-Transduktion eine stabile und effiziente Luciferaseaktivität in der statischen bzw. dynamischen Kultur verglichen mit der Kontrollebehandlung erreicht (26,3 ±0,2 versus 9,8 ±0,1 RLU/µg Gesamtprotein in statischer Kultur und 30,6 ±0,1 versus 9,9 ±0,1 RLU/µg Gesamtprotein in dynamischer Kultur am Tag 21, also ein bis zu 3.1-facher Unterschied, P≤0.001).
Schlussfolgerungen: rAAV Vektoren können über einen längeren Zeitraum humane Knochenmarkaspirate modifizieren und dabei hohe und stabile Transgenexpressionsraten in statischen wie auch in dynamischen Kulturbedingungen und in Rotationsbioreaktoren, in denen die Zelldichte sich erhöht, erreichen. Diese Ergebnisse suggerieren, dass die genetische Modifikation von Knochenmarkaspiraten via rAAV wertvoll ist, um geeignete, dauerhafte Behandlungen für Knorpelläsionen zu entwickeln.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-579
doi: 10.3205/14dkou505, urn:nbn:de:0183-14dkou5054
Published: October 13, 2014
© 2014 Venkatesan et al.
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by G. H. | Feb 19, 2019 | Konservative Orthopädie, News
TGF-β1-freisetzende Poly(Ether-Ester)-Multiblock-Scaffolds ermöglichen eine effiziente chondrogene Differenzierung von human mesenchymalen Stammzellen
Rey Rico A, Venkatasan JK, Sohier G, Moroni L, Madry H
Fragestellung: Die Verbesserung der Chondrogenese von mesenchymalen Stammzellen (hMSZs) ist ein Ziel zur Verbesserung der Knorpelreparatur. Der Wachstumsfaktor TGF-β ist ein kritischer Induktor der Chondrogenese. Jedoch limitiert seine kurze Halbwertzeit seinen klinischen Nutzen. Wir testeten die Eignung von mit TGF-β1 beschichteten porösen Scaffolds zur verzögerten Freisetzung von TGF-β1 und effizienten chondrogenen Differenzierung von hMSZ ohne zusätzliche Zugabe von TGF-β.
Methodik: Poly(Ether-Ester)-Multiblock-Scaffolds wurden mit TGF-β beschichtet. Anschließend wurden Zellaggregate von hMSZs über 21 Tage in chondrogenem Medium (ohne oder mit TGF-β) kultiviert: Pellets ohne Scaffold mit TGF-β1 (10 ng/ml) (Gruppe 1); Pellets mit unbeladenen Scaffolds mit TGF-β1 (Gruppe 2); Pellets mit TGF-β1-beladenen Scaffolds (TGF-β-Scaffolds), ohne TGF-β1 (Gruppe 3); Pellets mit unbeladenen Scaffolds ohne TGF-β1 (Gruppe 4). TGF-β1 wurde per ELISA quantifiziert, Pelletgröße digital bestimmt. Paraffinschnitte wurden mit Toluidinblau, H&E und Alizarinrot sowie per Typ-II- und -X-Kollagenimmunhistochemie gefärbt. Grad der Chondrogenese und hypertrophe Differenzierung wurde per Bewertungssystem, Glykosaminoglykan- (GAG) und DNS-Gehalt wurden biochemisch bestimmt, Genexpression per Realtime-RT-PCR analysiert. Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt (jede Kondition: 3 Pellets, n=3 Experimente).
Ergebnisse: Ergebnisse: TGF-β-Scaffolds setzten TGF-β1 kontrolliert für mindestens 21 Tage frei, mit einer Abgabe von ~10% innerhalb dieser Zeit. Während Pellets in Gruppe 4 zerfielen, waren die Durchschnittsgrößen der Pellets der übrigen Gruppen gleich (Gruppe 1: 1,02±0,06 mm; Gruppe 2: 1,02±0,06 mm; Gruppe 3: 1,00±0,04 mm)(P ≥ 0,3). Vergleichbare Muster der Chondrogenese zeigten sich bei Pellets mit TGF-β-Scaffolds (Gruppe 3) und den Gruppen 1 und 2 (Gesamtscore: 8,13±0,06; 8,79±0,29 und 9,13±0,18; jeweils Gruppen 1-3) versus 0,58±0,12 in der Abwesenheit von TGF-β1 (Gruppe 4). Der höchste GAG-Gehalt der Pellets (≥ 94% im Pellet, ≤ 6% sezerniert) wurde in allen mit TGF-β1 behandelten Pellets (Gruppen 1-3) nachgewiesen, im Vergleich mit Pellets der Negativkontrolle (~60% im Pellet, ~40% sezerniert; Gruppe 4). Keine hypertrophen Veränderungen fanden sich in den TGF-β1-behandelten Pellets (Gesamtswert: 2,25±0,12; 2,21±0,18 und 2,29±0,06; jeweils Gruppen 1-3) im Vergleich mit Kontrollpellets (4,96±0,41; Gruppe 4). TGF-β1-Scaffolds stimulierten eine ~200- bzw. 700-fache Erhöhung der Aggrecan- bzw. Typ-II-Kollagen-Expression verglichen mit der Zugabe von TGF-β1 zum Medium.
Schlussfolgerungen: TGF-β1-beladene Multiblock-Scaffolds geben kontrolliert bioaktives TGF-β1 ab. Sie erlauben die Chondrogenese von hMSZ ohne Zugabe von exogenem TGF-β1. Diese Scaffolds könnten klinisch zukünftig bei der Mikrofrakturierung fokaler Knorpeldefekte in die Perforationen des subchondralen Knochens implantiert werden, um die Knorpelreparatur zu verbessern.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-1056
doi: 10.3205/14dkou504, urn:nbn:de:0183-14dkou5049
Published: October 13, 2014
© 2014 Rey Rico et al.
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by G. H. | Feb 19, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Simulation degenerativer und pro-inflammatorischer Bedingungen zur Testung der Zelltherapie im Bandscheiben-Organkultursystem
Neidlinger-Wilke C, Teixeira GPQ, Boldt A, Mollenhauer J, Wilke HJ, Barbosa MA, Ignatius A, Goncalves R
Fragestellung: Der Erfolg einer zelltherapeutischen Behandlung der Bandscheiben-degeneration erfordert die Überlebensfähigkeit und Aktivität injizierter Zellen in einer Umgebung, die durch geringe Nährstoffversorgung, niedrige Osmolarität und inflammatorische Bedingungen geprägt ist. Im bovinen Organkultursystem haben wir degenerative und inflammatorische Bedingungen simuliert und die Eignung dieses Ansatzes zur Testung des Schicksals injizierter Zellen unter diesen Bedingungen überprüft.
Methodik: Organkulturen aus bovinen Bandscheiben (je 5-6 Stück pro Präparat) wurden nach 6 Tagen Vorkultur mit einer Nadel punktiert und für 2 Tage mit inflammatorischen Faktoren behandelt (LPS, IL1β) bzw. als unbehandelte Kontrollen belassen. Die Induktion einer inflammatorischen Antwort wurde durch Prostaglandin-(PGE2)-Analyse der Medienüberstände und Expressionsanalyse der isolierten Zellen bezüglich inflammatorischer Zytokine, MMPs, Aggrecan und Kollagen Typ II (Koll-2) untersucht. Das Stoffwechselprofil der Organkulturen wurde über den Glucoseverbrauch bestimmt. Zur Simulation normaler oder degenerativer Bedingungen wurde das Kulturmedium auf Normalbedingungen (5mM Glucose, 400 mOsm) oder Nährstoffmangel (0,05 mM Glucose, 300 mOsm) eingestellt. Einem Teil der Bandscheiben wurden fluoreszenz-markierte Bandscheiben-Zellen (PKH-67/26) in einem Albumin-Hydrogel injiziert. Bandscheiben mit injizierten Zellen wurden nach 1, 2 und 4 Wochen Inkubationszeit histomorphologisch und immunhistochemisch analysiert und der Glycosaminoglycan-(GAG)-Gehalt wurde bestimmt.
Ergebnisse: Die PGE2-Konzentration wurde durch Behandlung der Organkulturen mit LPS (10 µg/mL) oder IL1β (10 ng/mL bzw. 100 ng/mL) im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen signifikant erhöht (jeweils 21.7±0.8-fach, 5.5±0.9-fach bzw. 9.6±0.8-fach, n=27, p<0.0001). Erste Ergebnisse zeigten in Zellen, die aus LPS- oder IL1β-behandelten Proben isoliert wurden, eine erhöhte Expression von IL-6, IL-8, MMP-1 and MMP-3 und eine Erniedrigung der Koll-II und Aggrecan-Expression. Der GAG-Gehalt der Proben nahm während 2 Wochen Kulturzeit deutlich ab (62,4 ± 9%). Bezüglich der Glucose-Verbrauchswerte und der Lactat-Produktion zeigten die behandelten Proben ähnliche Werte wie die Kontrollen und lagen oberhalb des kritischen Mangel-Grenzwertes (1mM). Fluoreszierende Zellen konnten zu jedem Zeitpunkt im Gewebe nachgewiesen werden, mit nur geringen Unterschieden zwischen den verschiedenen Kulturbedingungen.
Schlussfolgerung: Durch Simulation degenerativer oder inflammatorischer Umgebungsbedingungen konnten wir in Organkulturen eine PGE2-Erhöhung, eine Expressionserhöhung von MMPs und Interleukinen sowie eine erniedrigte Matrixprotein-Expression induzieren. Der Nachweis injizierter fluoreszenz-markierter Zellen ermöglicht die Charakterisierung der Zellreaktionen unter Simulation einer degenerativen Umgebung. Dieses Modell bietet vielversprechende Möglichkeiten zur In-vitro-Testung regenerativer und anti-inflammatorischer Therapien der Bandscheibendegeneration.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-721
doi: 10.3205/14dkou503, urn:nbn:de:0183-14dkou5031
Published: October 13, 2014
© 2014 Neidlinger-Wilke et al.
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by G. H. | Feb 3, 2019 | Fuß, Hüfte + Endoprothetik, Knie + Endoprothetik, News
Die valgisierende Standardkorrektur verbessert die Reparatur fokaler Knorpeldefekte – eine translationale Studie im Schafmodell
Goebel L, Orth P, Müller A, Zurakowski D, Pape D, Kohn DM, Cucchiarini Madry M, Madry H
Fragestellung: Markraumstimulierende Verfahren sind zur Behandlung kleiner symptomatischer Knorpeldefekte indiziert. Der Einfluss der Beinachse auf die Reparatur von fokalen Knorpeldefekten ist jedoch weitgehend unklar. Wir testeten daher die Hypothese, dass die Entlastung vollschichtiger Knorpeldefekte im lasttragenden medialen Femurkondylus durch valgisierende Tibiakopfosteotomien (HTO) zur verbesserten Knorpelreparatur im präklinischen Schafmodell im Vergleich zu einer erhöhten Belastung durch Varisierung führt. Weiterhin wurde die Hypothese getestet, dass eine valgisierende Standardkorrektur zu besseren Ergebnissen als Überkorrektur führt.
Methodik: Bei 19 adulten Merinoschafen wurden bilateral vollschichtige Knorpeldefekte (4 x 8 mm) im medialen Femurkondylus gesetzt und durch Pridiebohrung therapiert. Alle rechten Hinterbeine erhielten eine mediale, biplanare HTO (TomoFix small stature): (a) schließende HTO (5,5° Varus; n=4), (b) öffnende HTO (6,5° Valgus; Standardkorrektur; n=10), (c) öffnende HTO (11,5° Valgus; Überkorrektur; n=5). Linke Hinterbeine dienten als Kontrolle. Postoperativ war Vollbelastung erlaubt. Nach sechs Monaten erfolgten verblindete Analysen per 9,4 Tesla Hochfeld-MRT (µMRT, 2D MOCART Score), makroskopischem Score, Mikrocomputertomographie (µCT), Immunhistochemie für Typ I- und II-Kollagen und Histologie (Sellers Score). Statistische Auswertung unter Anwendung Quasi-Likelihood-Methoden und verallgemeinerter Schätzungsgleichungen (SPSS, Armonk, USA). Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben mit signifikantem P<0,05.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Makroskopisch führte die valgisierende Standardkorrektur zu verbesserter Farbe (P=0,012), Oberfläche (P<0,001) Defektfüllung (P=0,002) und Gesamtpunktzahl (P=0,019). Im µMRT zeigte sich eine verbesserte Defektfüllung (P<0,001) und MOCART-Gesamtpunktzahl (P=0,034). Histologisch ergab die valgisierende Standardkorrektur beste Werte für Defektfüllung (P<0,001) und Gesamtpunktzahl (P=0,011). Varisierung verschlechterte Zellmorphologie (P=0.016) und Typ-II-Kollagen-Immunfärbung (P<0,001). Die Knochendichte der subchondralen Knochenplatte war im µCT nach Varisierung (P=0,046) und valgisierender Überkorrektur (P=0,001) reduziert.
Eine valgisierende Standardkorrektur führt im translationalen Schafmodell zu signifikant verbesserter makroskopischer und struktureller Knorpelreparatur im medialen Femurkondylus im Vergleich zu den Kontrollen. Eine Überkorrektur sollte vermieden werden. Diese translationalen Ergebnisse unterstützen das Konzept der Entlastung von vollschichtigen Knorpeldefekten in lasttragenden Bereichen des medialen Femurkondylus bei Patienten mit Varusfehlstellung.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-1470
doi: 10.3205/14dkou500, urn:nbn:de:0183-14dkou5001
Published: October 13, 2014
© 2014 Goebel et al.
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by G. H. | Feb 3, 2019 | Fuß, Hüfte + Endoprothetik, Knie + Endoprothetik, News
Integration von nativen Knorpelgewebstransplantaten im Schafsmodell
Gelse K, Pachowsky M, Hennig FF, Trattnig S, Welsch G
Fragestellung: Das Ziel dieser Studie bestand darin, in einem Schafsmodell die Integration von nativen Knorpelgewebstransplantaten mit dem umgebenden Gewebe von Knorpeldefekten zu untersuchen. Hintergrund dieser Arbeit sind Beobachtungen neuerer Studien, welche den Chondrozyten prinzipiell die Fähigkeit zur Migration aus der Knorpelmatrix heraus zubilligen, wodurch der Begriff des sogenannten „integrative cartilage repair“ postuliert wurde.
Methodik: In adulten Schafen (n=12) wurden Knorpeldefekte (5 mm Durchmesser) in der medialen Femurcondyle mit 4 unterschiedlichen Reparaturverfahren behandelt (n=6 je Gruppe). In die Defekte wurden 1 mm dicke native Knorpelgewebe-Chips (Transplantate) eingesetzt, die zuvor aus dem Randbereich der Trochlea isoliert wurden. Die subchondrale Knochenlamelle wurde dabei entweder intakt belassen oder mittels je 5 Mikrofrakturierungen penetriert. Als Kontrollen dienten entweder unbehandelte Defekte mit intakter subchondraler Knochenlamelle oder Defekte, die lediglich mit reiner Mikrofrakturierung behandelt wurden.
Die Analyse der Defekte und der Reparaturgewebe erfolgte nach 6 und 26 Wochen mittels histologischer Methoden (ICRS II Score, modifizierter O’Driscoll Score).
Ergebnisse: In diesem Schafsmodell zeigten unbehandelte und mittels Mikrofrakturierung behandelte Defekte eine durchweg inkomplette Defektauffüllung mit minderwertigem Faserknorpel. Beim Einsetzen von nativen Knorpelgewebstransplantaten kam es in 60% (6 Wochen) bzw. 41% (26 Wochen) der Fälle zu einer Delamination bzw. Dislokation der Transplantate. Ursache hierfür war eine insuffiziente laterale Integration mit dem umgebenden Knorpel und eine komplett ausgebliebene basale Integration mit der darunterliegenden kalzifizierten Knorpelschicht. Eine Zellmigration bzw. ein Auswachsen von Chondrozyten aus der Matrix der Transplantate heraus konnte in dieser in vivo- Studie nicht regelhaft nachgewiesen werden. Die Matrix der Transplantate neigte hingegen während der Untersuchungszeiträume zur Degeneration mit erheblichen Proteoglykanverlust.
Im Gegensatz dazu zeigten die Transplantate in Defekten mit arrodierten Knochenmark und entfernter basaler kalzifizierter Knorpelschicht eine signifikant bessere basale und laterale Integration. Die einsprossende Zellen aus dem Knochenmark fungierten offenbar als Defektfüller und trugen zur besseren Integration bei.
Schlussfolgerung: Ein sogenanntes „integrative cartilage repair“ mit spontanem Auswachsen und Migration von Chondrozyten aus nativen Knorpelgewebstransplantaten heraus konnte in diesem Modell nicht regelhaft nachgewiesen werden. Die Integration konnte hingegen durch einwandernde Zellen nach Arrosion des subchondralen Knochenmarks mittels Mikrofrakturierung verbessert werden.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-932
doi: 10.3205/14dkou499, urn:nbn:de:0183-14dkou4993
Published: October 13, 2014
© 2014 Gelse et al.
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