by G. H. | Aug 19, 2019 | Chirurgische Orthopädie, News
Steigerung der osteogenen Differenzierung und zellulären Verträglichkeit nach Zugabe von 3-Phasen-Kompositmaterialien in vitro durch Applikation von neurogenen Pharmaka
Böttner P, Hartmann S, Schleicher I, Heinemann S, Kruppke B, Hanke T, Schnettler R, Lips KS
Fragestellung: Die zunehmende Inzidenz osteoporotischer Frakturen führt zu einer verstärkten Nachfrage an Ätiologie-adaptierten Osteosynthesematerialien für den Einsatz in der Orthopädie und Unfallchirurgie. In einer in vitro Untersuchung wird die stimulierende Wirkung von neurogenen Pharmaka auf die Verträglichkeit von Kompositen bestehend aus Silikat, Kollagen und einer Calciumphase untersucht.
Methodik: Als in vitro Systeme wurden humane mesenchymale Stammzellen (MSC) aus dem Bohrmehl von osteoporotischen und knochengesunden Spendern sowie eine Endothelzelllinie, welche ursprünglich aus dem Knochenmark stammt (HBMEC), verwendet. Die Zellen wurden mit granuliertem Xerogel-Komposit unter Zugabe von brain derived neurotrophic factor (BDNF), Acetylcholin (ACh), Nikotin, dem Parasympathomimetika Carbachol und dem Insektizid Chlorpyrifos inkubiert. Neben der lichtmikroskopischen Kontrolle wurde nach 1, 3 und 5 Tagen die Vitalität mittels MTT-Test bzw. nach 1, 14 und 21 Tagen die Zellzahl mittels Picogreen-Assay, die Differenzierung mittels Alkalischer Phosphatase Assay und der Calciumverbrauch im Medium bestimmt.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Vitalität der Endothelzellen nach Zugabe von zwei Xerogel-Granulaten mit unterschiedlicher Calciumphosphatphase zeigten keine signifikanten Unterschiede untereinander. Die Kontrolle ohne Zugabe von Material wies jedoch eine deutlich gesteigerte Vitalität im MTT-Test auf. Die lichtmikroskopische Evaluation wies eine Adhäsion der Endothelzellen an die Materialien nach. Durch die Applikation von Nikotin (10-6 M, p<0,000) und ACh (10-4 M, p<0,000) erfolgte eine Stimulation der Endothelzellen, während das Insektizid Chlorpyrifos einen negativen Einfluss aufwies (10-3 M, p<0,000).
Bei der Differenzierung von MSC zu aktiven Osteoblasten wurden die Zellen von osteoporotischen und knochengesunden Spenderinnen verglichen. Im ALP-Assay zeigte sich ein signifikanter Anstieg der Differenzierung der osteoporotischen Zellen im Vergleich zu den knochengesunden Zellen (p<0,000). Diese Steigerung war unabhängig von den eingesetzten Materialien und Pharmaka. Der Calciumverbrauch im Medium wies keine signifikante Regulation auf.
Die humanen osteoporotischen MSC wiesen eine überraschend gute Differenzierungskapazität auf, die weder durch die Xerogel-Granulate noch durch die Pharmaka beeinflusst wurde, sodass aufgrund unserer Ergebnisse vermutet werden kann, dass die untersuchten Ersatzmaterialien für eine weitere Evaluation in vivo in einem osteoporotischen Tiermodell geeignet sind.
Gefördert durch DFG (SFB/TRR 79)
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocPO11-315
doi: 10.3205/14dkou581, urn:nbn:de:0183-14dkou5811
Published: October 13, 2014
© 2014 Böttner et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by G. H. | Jul 15, 2019 | Chirurgische Orthopädie, News
Einfluss der in vivo Immunmodulation des Transsignaling Systems auf die Knochenheilung im Trauma und Polytraumamodel der Maus
Kleber C, Reinhold JM, Malysch T, Schwabe P, Duda GN, Tsitsilonis S, Schmidt-Bleek K, Schaser KD
Fragestellung: Extremitätenverletzungen stellen die führenden Verletzungen im Rahmen des Polytraumas dar. Studien deuten auf die zentrale Rolle des IL-6 Zyotkinsystems im Rahmen der posttraumatischen Immunantwort hin. In einer klinischen Pilotstudie konnten wir erstmals die Interaktion der löslichen IL-6 Rezeptors (sIL-6R) und des Transsignaling (agonistische Funktion der plasmat. Bindung von IL-6 an den sIL-6R) mit dem Überleben zeigen. Weiterhin konnte unsere immunologischen Untersuchungen anhand des frühen Frakturhämatoms die Beteiligung des IL-6 an der Regulation der Frakturheilung zeigen.
Ziel unserer Studie ist die Untersuchung der Interaktion des Transsiganling mit der Frakturheilung im Polytrauma. Hierzu etablierten wir nach Genehmigung der Tierexperimente ein neues Polytraumamodell der Maus (hämorrhagischer Schock; Kettenverletzung: Femurosteotomie+Fixateur ext.; Tibiafraktur+Nagel).
Methodik: 36 C57/BL6 Mäusen (Alter: 12-14Wochen, Gewicht: 20-22 g) wurden bei 22± 2°C und einem 12h Tag/Nacht-Rhythmus gehalten. Nach 1 Woche Akklimatisierung erfolgte die Einteilung der Tiere in 2 Gruppen (Fx: Kettenverletzung; Polytrauma: Fx+ hämorrhagischer Schock). In beiden Gruppen erfolgten je 3 Interventionen: keine; Applikation i.p. 10ug sIL-6R; Applikation i.p. 100 ug sIL-6R Antikörper. Alle Operationen erfolgten in Inhalationsnarkose mit i.p. Analgesie. Die Induktion des Schockes erfolgte durch mikrochirurgische Arterotomie mit Einführen eines PE Schlauches zur sequentiellen Blutentnahme unter Messung des mittleren art. Blutdruckes mit Zielwert 35±5 mmHg. Die stand. Erzeugung der Femur-Fx erfolgte mittels Osteotomie und Stabilisation mit MouseExFix. Die Tibia-Fx wurde in der 3-Punkt Biegetechnik nach antegrader Nagelung der Tibia erzeugt. 21 Tage nach Trauma wurden die Tiere euthanasiert und die Knochenheilung des Femur mittels micro-CT Untersuchung analysiert.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Knochenheilung in der Fx- und Polytrauma-Gruppe unterschieden sich nicht signifikant. Die sIL6R-Gabe in der Fx-Gruppe zeigte im Vergleich zu keiner Modulation eine Verbesserung der Knochenheilung (p 0,001), wohingegen Polytrauma+sIL-6R Mäuse signifikant schlechter heilten (p 0,02). Die sIL-6R-AK Applikation in Poly-Mäuse hatte im Vergleich zu Polytrauma ohne Modulation oder sIL-6R Gabe eine signifikant verbesserte Knochenheilung zur Folge (p 0,009).
Wir konnten erstmals die Effekte einer in vivo Modulation des Transsignaling Systems auf die Knochenheilung im Trauma und Polytraumamodel zeigen. Unsere Ergebnisse zeigen die positiven Effekte des Transsignaling an der Regulation der frühen Knochenheilung. Beim Polytrauma kann durch eine Transsignaling vermittelte, überschießende und ungezielte Immunantwort, eine Verzögerung der Knochenheilung entstehen. Somit stellt das Transsignaling System eine der pathophysiologischen Ursachen für eine erhöhte Pseudarthrose-Rate beim Polytrauma dar.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR22-1285
doi: 10.3205/14dkou565, urn:nbn:de:0183-14dkou5654
Published: October 13, 2014
© 2014 Kleber et al.
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by G. H. | Jän 10, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
Induktion der osteogenen Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen durch Crosstalk mit Osteoblasten
Schmal H, Glück M, Alini M, Stoddart M, Südkamp NP, Salzmann GM
Fragestellung: An der natürlichen Knochenheilung sind sowohl Osteoblasten (OB) als auch mesenchymale Stammzellen (MSC) beteiligt, eine Zellkombination, die auch das Potential für Tissue Engineering Applikationen hat. Ziel dieser Studie war die Analyse des Einflusses von OB auf die osteogene Differenzierung von MSC unter Berücksichtigung der optimalen Zellkulturbedingungen und des Einflusses von TGFβ.
Methodik: Humane OB und MSC wurden in einer in vitro trans-well Ko-Kultur über 28 Tage untersucht. Die Kalzifizierung wurde spektroskopisch mit der optischen Dichte (OD) bei 450 nm und durch eine Alizarin-Rot-Färbung quantifiziert. Eine Analyse auf mRNA Niveau erfolgte mittels real time PCR.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: In der Ko-Kultur mit OB kam es zur osteogenen Differenzierung der MSC, wobei sich bei einer Konzentration von 1% fetalem Kälberserum (FCS) die meiste Kalzifizierung im Vergleich zu höheren FCS-Anteilen des Standarddifferenzierungsmediums zeigte (p<0,05). Verglichen mit einer Kultur von reinen MSC oder OB fand sich eine Zunahme der OD bei 450 nm im Zeitverlauf bei allen Kulturen, die höchsten Werte ergaben sich jedoch am Ende in der Ko-Kultur MSC/OB (p<0,05). Es bestand erwartungsgemäß ein erheblicher Niveauunterschied zwischen der MSC-Negativkontrolle und den Kulturen mit OB. Diese Ergebnisse konnten mit der Alizarin-Rot-Färbung bestätigt werden. Das osteogene Differenzierungspotential wies erhebliche interindividuelle Unterschiede auf. Eine Vorhersage gelang durch Korrelation der OD 450 nm-Werte und der mRNA-Expression von Alkalischer Phosphatase (ALP) mit der population doubling rate (PDR) in der Expansionsperiode, wobei sich statistisch signifikante Zusammenhänge zwischen Proliferationsrate und Differenzierungspotential sowohl für OB als auch für MSC zeigten (p<0,0001). Durch den Zusatz von TGFβ kam es zur Inhibition der Kalzifizierung bei gleichzeitiger Hochregulation von Kollagen Typ I und Sp7-mRNA sowie Suppression von ALP (p<0,05).
Die Ergebnisse bestätigen die Induktion der osteogenen Differenzierung von MSC durch benachbarte OB am ehesten bedingt durch Sekretion parakriner Faktoren. Die Differenzierungsfähigkeit weist individuelle Unterschiede auf, welche durch eine Bestimmung der Proliferationsrate vorhergesagt werden kann. TGFβ scheint dabei die ersten Differenzierungsschritte zu unterstützen, die endgültige Kalzifizierung jedoch zu inhibieren.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR13-397
doi: 10.3205/14dkou486, urn:nbn:de:0183-14dkou4866
Published: October 13, 2014
© 2014 Schmal et al.
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