Verbesserte Knochenneubildung durch ein Bioglas-Polymer besiedelt mit osteogen vordifferenzierten stromalen Knochenmarkzellen

Verbesserte Knochenneubildung durch ein Bioglas-Polymer besiedelt mit osteogen vordifferenzierten stromalen Knochenmarkzellen und frühen endothelialen Vorläuferzellen im critical size Schädelkalottendefektmodell der Ratte

Henrich D, Eldesoqi K, Nau C, Marzi I, Seebach C

Fragestellung: Komposite aus Bioglas (BG) und polylaktischer Säure (PLA) sind vielversprechende Materialien für das Knochen-Tissue Engineering. Gleichfalls ist bekannt, dass stromale Knochenmarkzellen (MSC) und frühe endotheliale Vorläuferzellen (EPC) in Kombination mit Knochenersatzmaterialien die Knochenneubildung signifikant verbessern und das osteogen vordifferenzierte MSC zu einer verbesserten Knochenneubildung führen können. Jedoch ist nur wenig bekannt, ob MSC und EPC auf derartigen Kompositmaterialien adhärieren und in vivo die Knochenneubildung unterstützen. Daher untersuchten wir in der vorliegenden Studie die Adhäsion von MSC, osteogen differenzierten MSC (dMSC) und EPC auf Kompositen mit steigendem BG-Gehalt (Korngröße 106-125 µm) in vitro sowie den Effekt auf die Knochenneubildung im Schädelkalottendefektmodell der Ratte in vivo.

Methodik: Die Studie wurde durch die lokale Tierversuchskommission genehmigt. MSC wurden aus Rattenfemur, EPC aus Rattenmilzen isoliert und nach Standardprotokollen kultiviert. Osteogene Differenzierung erfolgte über 3 Wochen nach Standardprotokollen. MSC+EPC, bzw. dMSC+EPC wurden auf PLA, PLA+20%BG (BG20), sowie PLA+40%BG (BG40) ausgesät. Adhäsion (2 h nach Aussaat) sowie Vitalität (24h nach Aussaat) wurden semiquantitativ fluoreszenzmikroskopisch evaluiert. Gleiche Ansätze wurden in ein Schädelkalottendefektmodell an männlichen SD-Ratten (6 mm Durchmesser, n=8-10/Gruppe) implantiert. Nach 14 Wochen wurden die Schädel histologisch aufgearbeitet. Evaluation der Knochenneubildung erfolgte histomorphometrisch an HE-gefärbten Schnittpräparaten (% Knochengewebe). Statistik: ANOVA + posthoc-Analyse, Bonferroni-korrigiertes p<0.05 ist signifikant.

Ergebnisse und Schlussfolgerung: In vitro: Es bestanden keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Adhäsion und Vitalität von MSC, dMSC und EPC zwischen den Testmaterialien. In vivo: Weder Infektion noch verzögerte Wundheilung wurden beobachtet. Im Vergleich zum leeren Defekt (11%) war die Knochenneubildung bei Verwendung von PLA (24%) und BG20 (30%) im Trend, gegenüber BG40 signifikant erhöht (39%). Bei Verwendung osteogen vordifferenzierter MSC konnte eine weitere Steigerung der Knochenneubildung verzeichnet werden (PLA:34%, BG20:42%, BG40:49%). Insbesondere in der BG40-Gruppe konnte häufig eine durchgehende knöchernde Durchbauung des Defekts beobachtet werden.

Es konnte gezeigt werden, dass Komposite aus Bioglas für die aufgebrachten Zellen verträglich sind, dass die Knochenneubildung mit steigendem BG-Anteil zunimmt und dass eine osteogene Vordifferenzierung der MSC die Knochenneubildung über den Bioglaseffekt hinaus weiter befördern kann. Frühere Analysen zeigten, dass insbesonders aus dem Bioglasanteil freigesetzte Calcium-Ionen zellprotektive Effekte auf EPC ausüben (eigene Daten) sowie die osteogene Kapazität von MSC verbessern. Es ist daher zu vermuten, dass dieser Effekt zu der verbesserten Knochenneubildung bei Verwendung von BG40 beigetragen hat.

 

Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR13-679

doi: 10.3205/14dkou484urn:nbn:de:0183-14dkou4845

Published: October 13, 2014
© 2014 Henrich et al.
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Vergleich des Potenzials autogener und allogener mesechymaler Stammzellen zur Regenration von Knochendefekten im Mausmodell

Vergleich des Potenzials autogener und allogener mesechymaler Stammzellen zur Regenration von Knochendefekten im Mausmodell

Rapp A, Bindl R, Erbacher A, Kemmler J, Müller I, Rojewski M, Schrezenmeier H, Ignatius A

Fragestellung: Durch ihres hohen Regenerationspotenzials und ihrer geringen Immunogenität stellen mesenchymale Stammzellen ein vielversprechendes Werkzeug für die Behandlung von Knochendefekten dar. Während der Nutzen autogener Stammzellen für die Knochenregeneration anerkannt ist (Kon et al. 2000, Hernigou et al. 2005), ist die Nutzbarkeit allogener Zellen weniger untersucht. Kürzlich wurde in einer experimentellen Studie eine gleichwertige Knochenbildung nach Verwendung autogener und allogener MSC berichtet (Berner et al. 2013). In anderen Ansätzen wurde jedoch eine geringere Wirkung der allogenen MSC auf die Knochenbildung beschrieben (Niemeyer et al. 2010). Da die Nutzung allogener MSC die größten Nachteile autogener Zellen wie limitierte Verfügbarkeit und langwierige Expansion beheben würde, sind weitere Untersuchungen zur Nutzbarkeit allogener MSC nötig. In dieser Studie vergleichen wir das Potenzial autogener und allogener MSC zur Regeneration von Knochendefekten in einem humanisierten Maus-Modell.

Methodik: Um eine Maus mit humanisiertem Immunsystem zu generieren wurden NOD/scid-Il2Rγ 0-Mäuse sublethal bestrahlt und mit humanen hämatopoetischen Stammzellen behandelt. Nach der Rekonstitution des Immunsystems wurde ein 1 mm Defekt im rechten Femur geschaffen und mit einem Fixateur externe stabilisiert. Der Defekt wurde mit autogenen oder allogenen MSC in einer Kollagenmatrix oder nur Kollagen gefüllt. Die Tiere wurden nach 10 oder 35 Tagen getötet. Die Heilung wurde mittels μCT und Histomorphometrie untersucht. Die Anwesenheit der transplantierten Zellen wurde durch Färbung von humanem β2-Microglobulin untersucht, zudem wurden humane CD8+-T-Zellen, CD31 und Runx2 mittels Immunfärbung nachgewiesen.

Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die transplantierten Zellen konnten an Tag 10 und 35 durch Färbung des humanen β2-Microglobulins in Defekten der autogenen und allogenen Behandlungsgruppe nachgewiesen werden. Im μCT wurde ein signifikant höherer Knochenanteil am Kallusvolumen (BV/TV) in der autogenen Gruppe im Vergleich zur allogenen (+129%) oder zellfreien (+127%) Gruppe detektiert. Dies wurde durch histomorphometrische Analysen bestätigt. Die Färbung von CD8 deutete in keiner der Behandlungsgruppen auf eine gegen das Implantat gerichtete Immunreaktion hin. Die Färbung von CD31 zeigte mehr gefärbte Zellen in Defekten der autogen behandelten Tiere. Die Färbung von Runx2 fiel in der autogen behandelten Gruppe stärker aus.

Unsere Ergebnisse deuten auf eine bessere Eignung autologer MSC zur Behandlung von Knochendefekten hin. Im Vergleich mit allogenen MSC oder zellfreiem Kollagen resultierte die Behandlung mit autogenen MSC in einem signifikant höheren Kochenanteil im Defekt. Wir konnten in keiner Gruppe eine gegen das Implantat gerichtete Immunreaktion detektieren. Färbungen osteogener und angiogener Marker zeigten eine stärkere Expression in der autogen behandelten Gruppe. Die legt den Schluss nahe, dass autogene MSC die Knochenformation über eine gesteigerte Angiogenese und Osteogenese begünstigen.

 

Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR13-606

doi: 10.3205/14dkou483urn:nbn:de:0183-14dkou4831

Published: October 13, 2014
© 2014 Rapp et al.
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