by R-Dorotka | Apr 3, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
Intracellular proliferation of S. aureus in osteoblasts and effects of rifampicin and gentamicin on S. aureus intracellular proliferation and survival
Mohamed W, Sommer U, Domann E, Schnettler R, Alt V
Objective: Staphylococcus aureus is the most frequent causal agent for bone infection. When S. aureus infection affects a total joint arthroplasty, removal and replacement of joint is mostly required. Moreover, it was recently discovered that S. aureus is able to invade osteoblasts thus escaping the extracellular host antibacterial defense and even antibiotics. This plays a significant role in persistence and recurrence of infection. The aim of this study was to investigate whether (1) S. aureus is able to not only invade but also proliferate within osteoblasts, (2) the mechanism of invasion and (3) to clarify whether rifampicin or gentamicin can inhibit intracellular proliferation and survival of S. aureus.
Method: SAOS-2 osteoblast-like cell line were grown in Minimum Essential Medium and subsequently infected with S. aureus EDCC5055 and S. aureus Rosenbach 1884 (ATCC 12598). In order to test the mode of bacterial internalization, SAOS-2 cells were treated 2h prior to infection with cytochalasin D which is the major actin depolymerization agent disrupting actin microfilaments. Immunofluorescence and transmission electromicroscopic (TEM) imaging were performed to detect potential intracellular and proliferating bacteria. For antibiotic experiments, SAOS-2 osteoblasts infected with S. aureus were treated with 7.5 microgram/ml of rifampicin or 30 microgram/ml, 100 microgram/ml, or 200 microgram/ml of gentamicin for 4h and 24h.
Results and conclusion: Both S. aureus strains were able to efficiently invade and to proliferate within human osteoblasts shown by typical bacterial growth curves. Immunofluorescence microscopy showed intracellular invasion of S. aureus and TEM images could demonstrate bacterial division as well as disruption of lysosomal membranes as a sign of successful intracellular proliferation and survival. Cytochalasin D was able to significantly reduce S. aureus invasion ability suggesting that invasion was enabled by promoting actin rearrangement at the cell surface. 7.5 microgram/ml of rifampicin was able to inhibit bacterial survival in human osteoblasts with almost complete elimination of bacteria after 4 h. Effects of gentamicin were dose-dependent but even high doses with 200 microgram/ml of gentamicin were associated with a statistically significant higher number of survived bacteria compared to rifampicin. In conclusion, S. aureus is not only able to invade but also to proliferate in osteoblasts. Invasion seems to be associated with actin rearrangement at the cell surface. Rifampicin is effective in intracellular eradication of S. aureus whereas gentamicin seems to have a much weaker intracellular effect. Based on these data, doses of rifampicin and gentamicin could be optimized for local use to coat end prostheses and be able to reach the intracellular compartments thus killing the probable intracellular persisting S. aureus without causing undesirable systemic side effects.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-1222
doi: 10.3205/14dkou524, urn:nbn:de:0183-14dkou5245
Published: October 13, 2014
© 2014 Mohamed et al.
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by R-Dorotka | Apr 3, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
In-vitro Studie zur individuellen lokalen Freisetzung verschiedener Antibiotika gegen bakterielle Erreger einsatzbedingter Osteomyelitiden
Back DA, Calafi A, Bormann N, Garbe LA, Schmidmaier G, Willy C, Wildemann B
Fragestellung: Die häufigsten Verwundungen von Soldaten in Afghanistan betreffen das muskuloskeletale System. Zur Verhinderung von Osteomyelitiden ist ein chirurgisches Debridement mit additiver systemischer Antibiotikagabe das Mittel der ersten Wahl. Dieses Konzept könnte durch eine zusätzliche lokale Antibiotikafreisetzung von Implantaten ergänzt werden. Diese in-vitro Studie sollte die Möglichkeiten einer bestehenden Implantatbeschichtung erforschen, unterschiedliche Antibiotika einzeln oder in Mehrfachbeschichtung wirkungsvoll gegen einsatzrelevante Osteomyelitiserreger freizusetzen.
Methodik: Titan-Kirschner-Drähte wurden mit Poly(D,L-Laktid) (PDLLA) und verschiedenen Antibiotika (Abx)-Konzentrationen (3 pro Abx) Ciprofloxacin, Gentamicin, Colistin, Daptomycin und Cefoxitin beschichtet, bei 37°C in NaCl eluiert und nach 4 h, 1, 3, 7, 14, 28 und 42 Tagen Proben entnommen (n=6). Mit den Eluaten wurde eine Hemmhofbestimmung nach Kirby-Bauer gegen gram-positive (Staph. aureus, MRSA) oder gram-negative (Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa) Bakterienstämme durchgeführt. Die Abx-Konzentrationen in den effektivsten Elutionsreihen wurden mittels Massenspektrometrie oder KIMS-Verfahren quantifiziert. In einem weiteren Ansatz wurden Doppelbeschichtungen mit Gentamicin und Colistin (n=6) gegen eine simulierte Mischinfektion mit Staph. aureus und einem multiresistenten A. baumannii getestet. Um toxische Effekte auf Knochenzellen auszuschließen, wurden Osteoblasten mit den verschiedenen Konzentrationen der jeweiligen Abx kultiviert. Die metabolische Aktivität und die alkalische Phosphatase wurden nach 3 Tagen gemessen.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Als Beschichtungskonzentrationen mit den effektivsten bakterienhemmenden Eigenschaften wurden 10% w/w für Gentamicin, Colistin und Ciprofloxacin, sowie 40% w/w für Daptomycin identifiziert. Außer Daptomycin zeigten alle Abx einen initialen Burst-release mit kontinuierlicher Freisetzung über 42 Tage. Daptomycin wies eine gesteigerte Freisetzung innerhalb der ersten 24h auf. Cefoxitin führte in keiner Beschichtungs-Konzentration zu einem inhibitorischen mikrobiologischen Effekt und war auch in der Freisetzungskinetik nur gering nachweisbar. Die Doppelbeschichtung mit Gentamicin und Colistin führte zu einer effektiven Freisetzung beider Antibiotika mit nachweisbarer Bakterienhemmung. Keine der Konzentrationen zeigte einen inhibitorischen Effekt auf Osteoblasten in-vitro.
Diese Studie zeigt, dass die Möglichkeit besteht, mittels PDLLA Antibiotikabeschichtungen für Implantate herzustellen, die auch individuellen Keimspektren angepasst sind. Hierbei sind auch Doppel-Beschichtungen mit Antibiotika möglich. Bei den Implantatbeschichtungen ist das Mengenverhältnis eingearbeiteter Medikamente zu berücksichtigen, ferner bei der Freisetzungskinetik die Halbwertszeit der Antibiotika. Die Ergebnisse unterstützen eine weitere Erforschung der gewählten Beschichtungen zur Bekämpfung von Osteomyelitis-induzierenden einsatzrelevanten Bakterienstämmen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-1440
doi: 10.3205/14dkou523, urn:nbn:de:0183-14dkou5231
Published: October 13, 2014
© 2014 Back et al.
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by R-Dorotka | Apr 3, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
In vitro Untersuchung neuer Antibiotika-Kombinationen mit Calciumsulsphat zur lokalen Behandlung von Knochen- und Gelenksinfekten. Die nahezu konstante Freisetzung von Ceftriaxon bietet neue Behandlungsmöglichkeiten
Rönn K, Wahl P, Bohner M, Decosterd L, Festa S, Gautier E
Fragestellung: Antibiotika werden bei Knochen- und Gelenksinfekten lokal eingesetzt, um die Probleme einer schlechten Penetration zu umgehen und das Risiko einer Organtoxizität bei systemischer Verabreichung zu vermeiden. Zusätzlich kann die Trägersubstanz dazu beitragen, postoperativen Totraum zu füllen. Klassisch lokal eingesetze Aminoglykoside wie Gentamicin oder Glykopeptide wie Vancomycin erlauben aber nicht alle Infekte adäquat abzudecken. Die Standart-Trägersubstanz ist bis heute PMMA-Zement, wodurch zusätzliche Operationen zur Entfernung nötig werden. Ausserdem wird das Antibiotikum nur zu Beginn in therapeutischen Dosen freigesetzt. Als bessere Substanz bietet sich Calciumsulphat (CaSO4) an. Es ist mit verschiedenen Antibiotika kompatibel, löst sich über die Zeit auf und kann resorbiert werden. Das Ziel dieser Studie war es, neue Kombinationen von Calciumsulphat mit verschiedenen Antibiotika, deren Freisetzung über die Zeit, antimikrobielle Aktivität sowie Stabilität in vitro zu bestimmen.
Methodik: Antibiotika-CaSO4-Kugeln wurden gemäss bekannter Methoden hergestellt. Das Verhältnis des Antibiotikums zum CaSO4-Hemihydratpulvers war 8%, die Zugabe von demineralisiertem Wasser erfolgte gemäss Bedarf, um das Material verarbeiten zu können. Überschüssiges Wasser wurde durch Dessikation vor dem Elutionsexperiment entfernt. Die gewählten Antibiotika waren Flucloxacillin, Piperaccillin/Tazobactam, Cefuroxim, Ceftriaxon, Ceftazidim, Cefepim, Meropenem, Ciprofloxacin, Levofloxacin und Clindamycin. Das Elutionsexperiment erfolgte über 6 Wochen, zuerst in PBS-Lösung, anschliessend in Rinderplasma, was mit Enoxaparin antikoaguliert wurde. Die Bestimmung der Antibiotikakonzentration erfolgte mit LC-MS/MS in regelmässigen Abständen aus der täglich gewechselten Elutionsflüssigkeit. Diese Chromatographieresultate wurden durch Agardiffusionstests bestätigt, je nach Antibiotikaspektrum mit S.aureus ATCC 25922 oder E. coli ATCC 35218.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Piperacillin-Tazobactam, Ceftazidim, Cefepim sowie Meronem zeigten eine rasche Reduktion der Konzentration sowie der Aktivität. Flucloxacillin und Cefuroxim blieben in klinisch relevanten Konzentrationen über 4 Wochen präsent. Ciprofloxacin und Levofloxacin sogar für 6 Wochen, wenn auch in zunehmend abnehmenden Konzentrationen. Diese liegen anfangs aber in einem Bereich, wo lokale Zelltoxizität zu erwarten ist. Flucloxacillin, Cefuroxim sowie Clindamycin könnten klinischen Einsatz finden, vor allem, wenn eine begrenzte Wirkungsdauer von Tagen bis Wochen erwünscht ist.
Herausstechend zeigte sich Ceftriaxon, wo eine nur leichte Abnahme der Konzentration von ca. 130 mg/l auf ca. 75 mg/l über 6 Wochen erfolgte, bei einer anhaltend hohen antimikrobiellen Aktivität.
Dieses Experiment eröffnet neue Möglichkeiten zum lokalen Einsatz von Antibiotika mit CaSO4 als resorbierbare Trägersubstanz. Insbesondere ist die fast konstante Freisetzung von Ceftriaxon von grossem Interesse, da hohe Konzentrationen über 6 Wochen beobachtet wurden.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-268
doi: 10.3205/14dkou522, urn:nbn:de:0183-14dkou5224
Published: October 13, 2014
© 2014 Rönn et al.
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by G. H. | Mrz 19, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
Molekulare Grundlagen der Beeinflussung hämodynamischer Parameter durch blaues LED-Licht in vitro und in vivo
Volkmar CM, Kotte K, Opländer C, Deck A, Born M, Liebmann J, Windolf J, Suschek C
Fragestellung: Eine gestörte Hämodynamik im Wundmilieu korreliert häufig mit einer verzögerten/gestörten Wundheilung; wohingegen durch exogene Applikation von Stickstoffmonoxid (NO) ein gestörter venöser sowie arterieller Blutfluss verbessert werden kann. Wir haben erstmals in vitro sowie in vivo den Einfluss der in der menschlichen Haut durch blaues Licht induzierten nicht-enzymatischen NO-Freisetzung auf die lokale Hämodynamik des lichtexponierten Hautareals untersucht.
Methodik: Es wurden in vivo-Studien an gesunden Probanden und in vitro-Studien an humanen Hautexplantaten und artifizieller humaner Epidermis durchgeführt. Für alle Studien liegen positive Ethikvoten vor. Als Lichtquelle diente ein LED-Array (light emitting diodes), welches gepulstes sowie ungepulstes Licht der Wellenlänge 453 nm emittierte. Die Bestimmung von NO und seiner bioaktiven Derivate (nitrosierte Thiole) erfolgte mittels Chemilumineszenz-Detektion. Toxizität wurde mittels MTT- und TUNEL-Assay quantifiziert. Der lokale Blutfluss wurde in vivo nichtinvasiv mittels eines Mirco-light Guide Spektrophotometers charakterisiert. Es wurden 100 µM Nitrit-Creme bzw. Nitrit-Lösung auf der Hautoberfläche aufgetragen.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Bestrahlung mit blauem LED-Licht mit Dosen von bis zu 250 J/cm2 führte in den Hautpräparaten zu keinen nekrotischen oder apoptotischen Ereignissen. Die Zellvitalität blieb unverändert. Weiterhin zeigten wir, dass blaues Licht in der Lage ist sowohl in vitro in bestrahlten Lösungen sowie in vivo in bestrahlter menschlichen Haut photolabile NO-Derivate (nitrosierte Thiole) zu NO zu spalten. Den zugrundeliegenden Mechanismus des Photozerfalls haben wir aufgeklärt. Weiterhin fanden wir eine eindeutige Korrelation zwischen der erwähnten Licht-induzierten kutanen NO-Generierung und einem signifikanten erhöhten (über 80 %) lokalen Blutfluss in oberflächlichen (1-2 mm) sowie tieferen (6-8 mm) Hautregionen. Dabei zeigte sich, dass bezüglich der Blutflusserhöhung die intrakutane Einbringung höherer Lichtenergien durch die Verwendung gepulster Lichtquellen einen eindeutigen Vorteil gegenüber konstanten Lichtquellen hatte. Darüberhinaus konnten vor der Strahlung aufgetragene Nitrit-Lösungen den kutanen NO-Speicher sowie die erwähnte Steigerung des Blutflusses erhöhen.
Diese Ergebnisse zeigen, dass blaues LED-Licht nebenwirkungsarm die Durchblutungsrate der Haut signifikant steigert, wobei gepulstes Licht sich trotz minimalem Temperaturanstieg an der Hautoberfläche am effektivsten erweist. Dieser Anstieg korreliert mit der Menge der intrakutan erzeugten NO-Rate sowie der Menge bioaktiver NO-Derivate im bestrahlten Hautareal.
Aufgrund der beobachtete Effekte bietet blaues Licht zur Steigerung der NO-abhängigen oberflächlichen, lokalen Durchblutung eine sinnvolle Ergänzung in der Therapie von Wunden, die durch eine hämodynamische Störung charakterisiert sind. Auch das zusätzliche Auftragen einer Nitrit-Lösung könnte in Betracht gezogen werden.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-1202
doi: 10.3205/14dkou518, urn:nbn:de:0183-14dkou5181
Published: October 13, 2014
© 2014 Volkmar et al.
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by G. H. | Mrz 19, 2019 | Chirurgische Orthopädie, News, Schulter
Die Inhibition der Phosphodiesterase 5, jedoch nicht der Phosphodiesterase 3, reduziert die Gewebenekrose in kritisch perfundierten muskulokutanen Lappen am atherosklerotischen Mausmodell
Mörsdorf P, Schröder T, Pohlemann T, Menger M, Holstein JH
Fragestellung: Ischämiebedingte Mikrozirkulationsstörungen mit nachfolgender Nekrose stellen in der plastischen und rekonstruktiven Lappenchirurgie nach wie vor ein Problem dar, welches letztlich im partiellen oder vollständigen Lappenverlust münden kann. Neben Minderperfusion spielen Entzündung und endotheliale Dysfunktion dabei eine entscheidende Rolle. Insbesondere Patienten mit Atherosklerose weisen Perfusionsstörungen auf, welche diese Ischämie verstärken können. Ziel dieser Studie war es zu untersuchen, welchen Einfluss eine medikamentöse Präkonditionierung mit spezifischen Inhibitoren der Phosphodiesterase auf Mikrozirkulation und Perfusionsausfall eines random pattern flap unter atherosklerotischen Bedingungen hat.
Methodik: An ApolipoproteinE-defizienten Mäusen wurde ein random pattern flap gehoben und in einer Rückenhautkammer fixiert. Mittels repetitiver Fluoreszenzmikroskopie analysierten wir die Mikrozirkulation, wobei die Ausdehnung der Gewebenekrose sowie die funktionelle Kapillardichte jeweils im proximalen, zentralen und distalen Lappenanteil als Endpunkte dienten. Zusätzlich wurde am Versuchsende das Serum-Gesamtcholesterin bestimmt und mit dem des Wildtyps verglichen. Die Medikamentengabe erfolgte jeweils 24h vor Lappenhebung sowie an den ersten 4 Tagen des Versuchs. Die Tiere wurden randomisiert folgenden Versuchsgruppen zugeteilt: (I) Cilostazol (Phosphodiesterase (PDE)3-Inhibitor; 30mg/kgKG; n=11); (II) Sildenafil (Phosphodiesterase 5-Inhibitor; 5mg/kgKG; n=11); (III) NaCl-behandelte Kontrollgruppe (n=9).
Ergebnisse und Schlussfolgerung: In der Kontrollgruppe zeigte sich ein zunehmender Ausfall der kapillaren Perfusion in allen Lappenarealen, was letztendlich zu einer Lappennekrose von ca. 65% führte. Die mit Sildenafil als Inhibitor der PDE 5 präkonditionierten Tiere wiesen eine etwas höhere Kapillardichte auf, was zu einer signifikant reduzierten Lappennekrose ab dem dritten Beobachtungstag führte (41%; p<0,05). Bei den mit Cilostazol als PDE3-Inhibitor behandelten Tieren ließ sich in allen Lappenanteilen eine wesentlich geringere Kapillardichte verzeichnen, welche ab Tag 7 in einem vollständigen Erliegen der kapillaren Perfusion mündete. Die resultierte in einer Gewebenekrose von insgesamt 76%. Die Gesamtcholesterinkonzentrationen der ApoE-Knockout-Mäuse waren im Vergleich zum Wildtyp um den Faktor 18 bis 21 erhöht (p<0,001).
Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine Inhibition der PDE 5 im kritisch perfundierten atherosklerotischen Mausmodell die Entstehung der Gewebenekrose vermindern kann. Dies stellt einen möglichen Ansatz dar, dem ischämiebedingten Lappenverlust bei Patienten mit manifester Atherosklerose vorzubeugen. Die Inhibition der PDE 3 führt hingegen zu einer weiteren Verschlechterung der Mikrozirkulation.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-1091
doi: 10.3205/14dkou517, urn:nbn:de:0183-14dkou5171
Published: October 13, 2014
© 2014 Mörsdorf et al.
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