by G. H. | Aug 5, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
CD271+ Zellen aus dem Knochenmark zur Herstellung von Knorpeltransplantaten im Schafsmodell
Petters O, Schmidt C, Zscharnack M, Marquaß B, Josten C, Schulz R
Fragestellung: Die Therapie von fokalen Schäden des hyalinen Knorpelgelenks kennt bereits verschiedene Ansätze der autologen Zelltherapie. Der gängige Einsatz von Chondrozyten im Rahmen einer (M)ACT bringt u.a. den Nachteil der Entnahmemorbidität von gesundem Knorpel mit sich. Die Mikrofrakturierung beinhaltet mittelfristig das Risiko der Bildung von minderwertigem Faserknorpel. Aktuelle Fallstudien zur Nutzung von Knochenmarkkonzentrat (BMAC) zeigen gute Therapieerfolge hinsichtlich der Regeneratqualität. Das BMAC enthält allerdings eine heterogene Mischung von Zellen, wobei derzeit unklar ist, welche Population für die Knorpelregeneration verantwortlich ist.
Wir konnten bereits in vitro zeigen, dass MSCs der CD271-positiven Subpopulation aus dem Schaf isoliert werden können und diese für die Regeneration von hyalinem Knorpel prädestiniert sind. Das Ziel war es nun zu zeigen, dass diese Zellen auch die qualitativen Anforderungen an eine Zelltherapie erfüllen (z.B. Identität, Reinheit und Potenz).
Methodik: Aus dem Knochenmarkaspirat von adulten Merinoschafen wurden mittels Erylyse die mononukleäre Zellen (bmMNCs) isoliert. Im Anschluss wurde ein Teil der Zellen mit CD271-spezifischen Magnetbeads markiert und über eine magnetische Zellseparation (MACS) aufgereinigt. CD271-positive MNCs, CD271-negative MNCs, unsortierte bmMNCs sowie primäre ovine Chondrozyten wurden in eine klinisch angewandte Kollagen-I-Matrix (Arthro Kinetics) eingesät und für 2 bzw. 3 Wochen chondrogen differenziert. Die Multipotenz und die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (CFUs) wurden parallel untersucht. Die Analyse der zell-besiedelten Gele beinhaltet die Bestimmung der Zellzahl, des Glykosaminoglykan-Gehalts (sGAG), makroskopische, histo- und immunhistologische Untersuchungen sowie die Erhebung von qPCR-Profilen relevanter knorpelspezifischer Marker.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Es konnte gezeigt werden, dass ovine, CD271-positive MNCs nahezu alle koloniebildenen Zellen im Vergleich zu CD271-negativen MNCs enthalten (2,8 vs. 0,4 CFUs / 1.000 Zellen). Die Multipotenz konnte bei allen sortierten und unsortierten bmMNC-Gruppen nachgewiesen werden.
Die 3D-Kultivierung in den Hydrogelen zeigte nach 2 bzw. 3 Wochen Inkubation, dass die CD271-positiven MNCs selbst bei 16fach niedrigerer Einsaatdichte vergleichbare Resultate hinsichtlich der Zellzahl, der -viablilität und des sGAG-Gehalts im Vergleich zu den unsortierten bmMNCs erreichen.
Mithilfe der hier skizzierten Voranreicherung potenter CD271-positiver Zellen konnte somit das Einbringen von nicht-chondrogen differenzierbaren Zellen in das autologe Knorpeltransplantat reduziert werden. Der klinische Einsatz am Menschen mithilfe des CE-zertifizierten CliniMACS Prodigy® (Miltenyi Biotec) ist in Vorbereitung. Hiermit ist zukünftig eine einzeitige, intraoperative Therapie von vollschichtigen, fokalen Knorpelschäden des Femorotibialgelenks möglich.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocSA33-1006
doi: 10.3205/14dkou575, urn:nbn:de:0183-14dkou5751
Published: October 13, 2014
© 2014 Petters et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by G. H. | Aug 5, 2019 | Chirurgische Orthopädie, News, Spezifische Orthopädie
Schädel-Hirn-Trauma und Knochenheilung: Radiologische und Biomechanische Analyse in einem kombinierten Trauma-Mausmodell
Locher R, Schaser KD, Lünnemann T, Garbe A, Schmidt-Bleek K, Haas NP, Wichlas F, Tsitsilonis S
Fragestellung: Es ist empirisch bekannt, dass Patienten mit Schädel-Hirn-Trauma (SHT) und Frakturen (Fx) der langen Röhrenknochen eine erhöhte Stimulation des Knochenmetabolismus zeigen können. Nur wenige klinische und experimentelle Studien widmen sich diesem Zusammenhang und analysieren die Radiomorphologie und Biomechanik der Frakturheilung nach SHT. Ziel unserer Studie war die radiologische und biomechanische quantitative Evaluation der Auswirkung des SHT auf die Knochenheilung anhand eines standardisierten, reproduzierbaren Trauma-Mausmodells.
Methodik: Weibliche C57/Black6N-Mäuse (n=138, 12 Wochen alt) wurden in 4 Gruppen unterteilt, wobei Femurosteotomie und SHT als Variablen dienten. I: Fx-Gruppe, nur Osteotomie n=33; II: SHT-Gruppe, nur SHT n=36; III: Kombinationsgruppe, SHT & Osteotomie n=39; IV: Kontrollgruppe, keine Intervention n=30. Die Femurosteotomie wurde mittels Fixateur externe und die SHT-Induktion mittels Controlled Cortical Impact Injury durchgeführt. Die in-vivo-Knochenheilung wurde wöchentlich mittels quantitativer (Knochenvolumen und -dichte) und qualitativer (Überbrückung des Osteotomiespaltes) Mikro-CT-Untersuchung für 3 bzw. 4 Wo postoperativ evaluiert. Nach Tötung erfolgte die biomechanische Torsionstestung des Femurs (Steife und Festigkeit).
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Kombinationsgruppe zeigte neben einem signifikant höheren Kallusvolumen (p<0.05) ab der 2. Woche mit Tendenz zur höheren Mineralisationsdichte (p=0.053) auch qualitativ eine höhere Überbrückungsrate im Vergleich zur Fx-Gruppe (Tabelle 1 [Tab. 1]).
Biomechanisch erwies sich der Kallus der Kombinationsgruppe hinsichtlich Festigkeit (p<0.05) stabiler mit Trend (p=0.057) zur höheren Steifigkeit verglichen mit der Fx-Gruppe (Tabelle 2 [Tab. 2]). Das isolierte SHT schien die Biomechanik des nicht verletzten Knochens negativ zu beeinflussen, da signifikant reduzierte Festigkeitswerte im Vergleich zu den unverletzten Kontrollen bis zu 3 Wochen nach Trauma erkennbar waren (p<0.05).
Die Daten bestätigen die klinische Hypothese der Stimulation der Frakturheilung bei einem SHT. Der neugebildete Kallus nach Fx & SHT hat sowohl ein höheres Volumen als auch eine höhere Mineralisierungsdichte und ist damit biomechanisch suffizienter und stabiler als bei isolierten Frakturen. Dass ein isoliertes SHT eher die Biomechanik des Knochens verglichen mit der Kontrollgruppe reduziert, lässt eine enge Interaktion von SHT und Frakturheilung mit Stimulation des Knochenstoffwechsels nur im Frakturfall vermuten. Die standardisierte Etablierung dieses Mausmodells erlaubt erstmals die serielle quantitative in-vivo-Analyse der durch SHT beschleunigten Frakturheilung und kann somit für weitere Studien zur therapeutischen Modulation der Interaktion von SHT und Frakturheilung dienen. Die Erklärung der biologischen Basis dieses Phänomens könnte neue Wege in der Optimierung der Behandlung von Knochendefekten, Pseudarthrosen und Osteoporose erschließen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocSA33-1573
doi: 10.3205/14dkou571, urn:nbn:de:0183-14dkou5711
Published: October 13, 2014
© 2014 Locher et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by G. H. | Jul 29, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
Der Einfluss von Erythropoietin und Knochenmarkkonzentrat auf die Heilung von osteochondralen Defekten
Betsch M, Santak L, Jungbluth P, Hakimi M, Herten M, Wild M
Fragestellung: Arthrose ist eine chronische Erkrankung des muskuloskeletalen Apparates, für die es bis heute keine Heilung gibt. Die verfügbaren Therapieoptionen sind begrenzt auf Schmerzreduktion, Aufrechterhaltung der Gelenkfunktion oder Verminderung von Folgeschäden. Seit längerem sind die nicht-hämatopoietischen Effekte von Erythropoietin (EPO) bekannt, welche in Zusammenhang mit dem zur Zytokin-I-Familie gehörenden EPO-Rezeptor gebracht werden. In Studien konnte der positive Einfluss von EPO auf die Proliferation und Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen gezeigt werden. Ziel unserer Studie war es daher erstmals den Einfluss von EPO, in Kombination mit Knochenmarkkonzentrat (BMAC), auf die Heilung von osteochondralen Defekten im Schweinemodell zu untersuchen.
Methodik: In 14 Göttinger Mini-Pigs wurde ein 6×10 mm großer osteochondraler Defekt (Figure 1) in der medialen Femurkondyle beider Knie gesetzt. Der Defekt wurde mit einem biphasischen Träger, bestehend aus einem Copolymer aus Poly-DL-Lactid- und Co-Glycolid, in Kombination mit einem der folgenden Zusätze behandelt: zellfreier biphasischer Träger ohne Zusatz (Kontrollgruppe), Träger mit EPO, Träger mit BMAC und Träger mit EPO und BMAC. Nach 26 Wochen wurden alle Versuchstiere euthanasiert und die osteochondrale Regeneration mittel Immunhistochemie und eines histologischen Scores ausgewertet. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit Student T-Tests und der univariaten ANOVA (modifiziert nach der Bonferroni Methode) untersucht.
Ergebnisse: Der Stammzellcharakter der im BMAC enthaltenen mesenchymalen Stammzellen wurde durch den Nachweis von stammzell-assoziierten Oberflächenmarkern (CD44 positiv in 90 ±8.3%, CD14 positiv in 91.2 ±7.6% und CD90 positiv in 89 ±11.3% aller Zellen), sowie durch die Differenzierung in Chondrozyten, Osteoblasten und Adipozyten bestätigt. In den Therapiegruppen zeigte sich mittels immunhistochemischer Färbungen Kollagen Typ II positives chondrogenes Regenerationsgewebe. Durch den Zusatz von EPO und BMAC zum biphasischen Träger konnte eine signifikante Verbesserung (p=0.02) im histologischen Score erreicht werden (17.71 ± 0.95 vs. 12.86 ± 3.24). Der Einsatz von EPO oder Knochenmarkkonzentrat alleine, führte jedoch zu keiner signifikanten Verbesserung des Scores (p=0.635 und p=0.093).
Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse unserer Studie zeigen, dass sich durch den Einsatz von EPO und BMAC eine Verbesserung der osteochondralen Defektregeneration im Schweinemodel erreichen lässt. Verantwortlich hierfür scheint der positive Einfluss von EPO und BMAC auf die lokale Mikroumgebung zu sein; wahrscheinlich bedingt durch eine Eingrenzung der Entzündungsreaktion, einer Reduktion der Nekrose, sowie einer Modulation und Rekrutierung von Stammzellen. Der Einsatz von EPO oder BMAC alleine führte nicht zu einer signifikanten Verbesserung der osteochondralen Heilung, was vermuten lässt, dass die Kombination aus einer Zellquelle mit Wachstumsfaktoren notwendig ist um die osteochondrale Heilung zu verbessern.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocSA33-974
doi: 10.3205/14dkou574, urn:nbn:de:0183-14dkou5745
Published: October 13, 2014
© 2014 Betsch et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by G. H. | Jul 29, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
Einführung eines kombinierten Traumamodells am peripheren Muskel und Nerv
Stratos I, Karle O, Mittlmeier T, Vollmar B
Fragestellung: Verletzungen der unteren Extremität, welche vorwiegend nach Frakturen oder Kompartmentsyndromen auftreten, sind mit sekundären Muskel- oder Nervenläsionen vergesellschaftet. Ziel unserer Studie war es die Veränderungen am Muskel und Nerv zu beschreiben, welche nach kombinierten Trauma auftreten.
Methodik: Für dieses Vorhaben verwendeten wir 24 Ratten und induzierten einen chronischen Nervenschaden mittels einer losen Ligatur am linken Nervus ischiadicus („chronic constiction injury“; CCI) oder ein sham-CCI (sCCI). Am 4. Tag unterzogen sich alle Tiere einer geschlossenen Kontusion des linken Unterschenkels („closed soft tissue injury“; CSTI) oder einer sham-CSTI (sCSTI). Nachfolgende Untersuchungen wurden am 8. Tag für alle 4 Gruppen durchgeführt (CCI/CSTI; sCCI/CSTI; CCI/sCSTI; sCCI/sCSTI; n=6 Tiere pro Gruppe). Das Schmerzempfinden wurde durch Analyse der thermalen und taktilen Allodynie quantifiziert. Die Analyse der Nervenleitgeschwindigkeit sowie der Neuronendichte (HE Analyse) des Nervus ischiadicus diente zur Evaluation des posttraumatischen Nervenschadens. Zur Erfassung der funktionellen Regeneration des Muskels erfolgte die Kraftmessung des Musculus soleus durch Provokation von Kurzkontraktion und Tetanie sowie die Analyse von Proliferation (BrdU Immunohistochemie) und Apoptose (TUNEL Histologie) im Muskel. Angegeben sind MW±SEM, ANOVA * p<0,05 vs sCCI/sCSTI, # p<0,05 vs sCCI/CSTI, + p<0,05 vs CCI/sCSTI.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die planimetrische Analyse des Nervus ischiadicus zeigte einen signifikanten Unterschied bei der Neuronendichte zwischen CCI und sCCI Gruppe, wobei sich diese nicht durch CSTI beeinflusste (Neuronen in % pro GF: CCI/CSTI: 78±6*; CCI/sCSTI: 74±7*#; sCCI/CSTI: 89±3; sCCI/sCSTI: 91±1). Die quantitative Analyse der thermalen und taktilen Allodynie ergab signifikante Unterschiede zwischen den CCI und den sCCI Gruppen, wobei lediglich CSTI keine Allodynie-Symptomatik induzieren konnte. Die Nervenleitgeschwindigkeit konnte bei der CCI/CSTI und der CCI/sCSTI nicht abgeleitet werden, während sCCI/CSTI und sCCI/sCSTI Tiere eine normale Latenzzeit von 0,33±0,04 und 0,28±0,04 ms aufweisen. Die Erfassung der Muskelkraft zeigte eine signifikante Reduktion sowohl der Kurzkontraktion als auch der Tetanie nach CCI. CSTI Induktion nach sCCI führte zu einer signifikanten Reduktion der Tetanie und einem moderaten Nachlass der Kurzkontraktion im Vergleich zu der sCCI/sCSTI Gruppe (Kurzkontraktion (N): CCI/CSTI: 0,04±0,01*#; CCI/sCSTI: 0,12±0,07*#; sCCI/CSTI: 0,34±0,06; sCCI/sCSTI: 0,39±0,03 und Tetanie (N): CCI/CSTI: 0,07±0,02*#; CCI/sCSTI: 0,08±0,02*#; sCCI/CSTI: 0,67±0,05*; sCCI/sCSTI: 0,83±0,05). Ähnliche Ergebnisse wurden für die Apoptose beobachtet (TUNEL positive Zellen (n/mm2): CCI/CSTI: 6,94±1,17*#+; CCI/sCSTI: 9,48±0,70*#; sCCI/CSTI: 2,69±0,33*; sCCI/sCSTI: 1,41±0,30). Analyse der Proliferation zeigte keine Unterschiede zwischen den Gruppen. Zusammenfassend kann vorliegende Studie als Modell zur Untersuchung von kombinierten Nerven- und Muskelschäden dienen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocSA33-953
doi: 10.3205/14dkou570, urn:nbn:de:0183-14dkou5701
Published: October 13, 2014
© 2014 Stratos et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by G. H. | Mrz 4, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Autologe Tenozyten führen in Kombination mit einem resorbierbaren Kollagen-Scaffold zur verbesserten biomechanischen und histologischen Sehnenregeneration bei Rotatorenmanschettendefekten im Großtier
Roßbach BP, Pietschmann MF, Kempfert L, Ficklscherer A, Gülecyüz MF, Schmitt B, Ullamann T, Müller PE
Fragestellung: Die Regeneration von Rotatorenmanschettendefekten wird zum großen Teil durch die Gewebebiologie nach Rekonstruktion bestimmt. Hierbei führen unzureichende Vaskularisierung, Inflammation und Bildung von Ossifikationen zu Rerupturen und unbefriedigenden klinischen Ergebnissen. Eine neue Methode zur Sehnenregeneration stellt die Verwendung von autologen Tenozyten mit Scaffolds dar. Aufgrund der Größe sowie der Ähnlichkeit der Strukturen zur humanen Anatomie eignet sich hierbei das Großtiermodell am besten. Hypothese unserer Studie war, dass autologe Tenozyten in Kombination mit einem resorbierbaren Kollagen-Scaffold zu einer verbesserten biomechanischen und histologischen Sehnenregeneration von Rotatorenmanschettendefekten im Großtier führen.
Methodik: Nach Gewebebiopsie an der Patellasehne an acht Schafen, enzymatischer Verdauung und Kultivierung der Zellen in einer high-density Kultur wurden zehn Millionen autologe Tenozyten auf einem resorbierbaren Kollagen-Scaffold besiedelt und in einen critical-size-Defekt am Sehnen-Knochen-Übergang der rechten Infraspinatussehne dieser Tiere implantiert (Gruppe III). Als Vergleichsgruppen dienten jeweils acht Schafe mit Implantation eines unbesiedelten Scaffolds (Gruppe II) bzw. mit reiner Defektsetzung (Gruppe I). Die Euthanasie erfolgte 12 Wochen postoperativ und die gewonnenen Sehnenregenerate wurden biomechanisch und histologisch untersucht. Die kontralateralen Schultern dienten hierbei als Kontrollgruppe.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: In der biomechanischen Analyse wurde jedes Sehnenregenerat mit einer Vorlast von 10 N und einer Rate von 500 mm/min unter Dislokationskontrolle bis zum Versagen getestet. Bei gesunden Kontrollsehnen wurde eine durchschnittliche maximale Reißkraft von 2995 N ermittelt. Gruppe III mit besiedeltem Scaffold wies mit einem Durchschnittswert von 2516 N eine deutliche biomechanische Überlegenheit im Vergleich zu den Gruppen I mit Defektsetzung und II mit unbesiedeltem Scaffold mit 2004 N bzw. 2088 N auf. In der histologischen Aufbereitung konnte in Gruppe III im Gegensatz zu den beiden anderen Gruppen durch die Verwendung von autologen Tenozyten eine geringere Entzündungsreaktion, ein besser angeordneter Faserverlauf sowie eine vermehrte Kollagen- als auch Proteoglykan-Synthese im neuen Sehnenregenerat nachgewiesen werden.
Autologe Tenozyten führen in Kombination mit einem resorbierbaren Kollagen-Scaffold zur verbesserten biomechanischen und histologischen Sehnenregeneration gegenüber unbehandelten Defekten bzw. Defektauffüllung mit unbesiedeltem Scaffold bei Rotatorenmanschettendefekten im Großtier. Es könnte sich bei dieser Methode um einen vielversprechenden Ansatz zur Reparatur von nicht verschließbaren Sehnendefekten handeln.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR16-227
doi: 10.3205/14dkou511 , urn:nbn:de:0183-14dkou5111
Published: October 13, 2014
© 2014 Roßbach et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
