by G. H. | Jän 21, 2019 | Arthrosetherapie, News
Die Rolle der synovialen Inflammation in der Pathogenese der Osteoarthrose
Moradi B, Hagmann S, Rosshirt N, Kirsch J, Lorenz HM, Tretter T, Zeifang F, Gotterbarm T
Fragestellung: Die Osteoarthrose (OA) ist eine der weitverbreitesten orthopädischen Erkrankungen mit bislang unbekannter Ätiologie. Die Pathophysiologie ist durch einen progredienten Verlust der Knorpel- und Knochensubstanz gekennzeichnet. Therapeutische Ansätze, um die Progression zu stoppen, gibt es nicht.
Während die OA primär als eine nicht-entzündliche Erkrankung angesehen wurde, wird den inflammatorischen Pathomechanismen in der Progression der OA eine zunehmende Bedeutung beigemessen. Die Bedeutung der lokalen Inflammation in dem Prozess der Knorpel- und Knochendestruktion sind jedoch bislang noch weitestgehend unbekannt.
Das Ziel dieser Arbeit war es die Präsenz von inflammatorischen Zellen und deren Zytokine in den Kniegelenken von OA Patienten zu untersuchen. Durch den Einschluss von Patienten mit Teilgelenks- und Vollgelenksarthrose sollte untersucht werden ob sich dieses Inflammationsmuster mit der Progression der OA verändert.
Methodik: Insgesamt wurden 59 Patienten (67 ± 11 Jahren) (26 Teilgelenks- und 23 Vollgelenksarthrose) in diese Studie eingeschlossen. Die Synovialmembran (SM) wurde durchflusszytometrisch auf die Präsenz von CD4+ T Helferzellen, CD8+ zytotoxischen T-Zellen, CD19+ B-Zellen, CD14+ Macrophagen und CD16+CD56+ natürlichen Killerzellen untersucht. Die korrespondierende Synovialflüssigkeit wurde quantitativ mittels Multiplex Analyse auf eine breite Anzahl an pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen untersucht. Die statistische Analyse erfolgte mittels t-test und Mann-Whitney U-Test.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Synovialmembran zeigte ein spezifisches Infiltrationsmuster, wobei CD14+ Makrophagen (16.6 ± 9.7%) und CD4+ T-Zellen (5.4 ± 6.3%) die beiden größten Zellpopulationen darstellten. Zytotoxischen CD8+ T-Zellen (1.9 ± 1.9%), CD19+ B-Zellen (3.1 ± 3.6%), und CD16+CD56+ natürlichen Killerzellen (0.02 ± 0.03%) waren nur zu einem geringen Anteil in den betroffenen Gelenken nachweisbar. Der Vergleich zwischen den beiden Gruppen zeigte eine signifikant höhere Infiltration (p=0.0009***) mit inflammatorischen Zellen bei Patienten mit Vollgelenksarthrose. In dieser Gruppe wurde auch eine signifikant (p=0.0267*) höhere Präsenz von CD4+ T-Zellen nachgewiesen. Die Analyse der SF zeigte zusätzlich, dass Pt. mit Vollgelenksarthrose signifikant höhere Werte an pro-inflammatorischen Zytokinen aufwiesen (IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, Eotaxin, CXCL1).
Die Infiltration von arthrotischen Gelenken mit inflammatorischen Zellen weist ein spezifisches Muster auf, welches sich mit der Progression der Erkrankung verändert. CD14+ Makrophagen und CD4+ T-Zellen scheinen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der OA zu spielen. Die höhere Präsenz von CD4+ T-Zellen bei der Vollgelenksarthrose und die signifikant höheren Werte an inflammatorischen Zytokinen lassen vermuten, dass die Inflammation mit der Progression der Erkrankung zunimmt. Die Manipulation dieser Zellpopulationen könnte ein neues therapeutisches Fenster in der Behandlung der OA eröffnen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR14-1416
doi: 10.3205/14dkou492, urn:nbn:de:0183-14dkou4929
Published: October 13, 2014
© 2014 Moradi et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by G. H. | Jän 14, 2019 | Arthrosetherapie, News
Synoviale T-Zell-Infiltration und Zytokinproduktion in Früh- und Endstadium der Arthrose
Rosshirt N, Hagmann S, Gotterbarm T, Tretter T, Lorenz HM, Zeifang F, Moradi B
Fragestellung: Die Osteoarthrose (OA) ist eine der häufigsten muskuloskelettalen Erkrankungen mit enormer sozioökonomischer Bedeutung. In der aktuellen Literatur wird der synovialen Inflammation in Entstehung und Progression der Erkrankung eine zunehmend wichtige Rolle beigemessen. Bereits in Frühstadien konnten MR-Studien eine Synovitis nachweisen. Immunhistochemische Studien zeigten, dass die SM durch ein mononukleäres Zellinfiltrat und proinflammatorische Zytokine charakterisiert ist. Der Fokus unserer Arbeit war, die inflammatorischen T-Zell-Subpopulationen und deren Zytokine im betroffenen Gelenk zu analysieren. Durch den Einschluss von Patienten im frühen und späten Stadium der Erkrankung sollte die Rolle der Inflammation in der Pathogenese der Osteoarthrose neu evaluiert werden.
Methodik: Proben der Synovialmembran (SM) und Synovialflüssigkeit (SF) wurde von insgesamt 120 Patienten (75w, 45m; Alter: 67.8 ± 8 Jahre) unterschiedlichen Stadiums (Kellgren-Lawrence I-IV) analysiert. Durch enzymatischen Verdau und Dichtegradientenzentrifugation wurden Mononukleäre Zellen (MNC) isoliert und durchflusszytometrisch nach Oberflächen- und intrazellulären Markern spezifisch für T-Zell Subpopulationen (Th1, Th2, Th17, Treg) untersucht. Deren Zytokinsekretion (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IFN-γ, TNF-α) in SF wurde mittels cytometric bead array (CBA) bestimmt.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: In der SM konnte eine signifikante Zunahme der Infiltration von CD4+ T-Zellen mit steigendem Arthrose-Stadium dokumentiert werden (p<0.05), die einen aktivierten Phänotyp aufweisen (CD69+, CD45RO+). Die größte Population in den intraartikulären Kompartimenten stellten die proinflammatorischen Th1-Zellen dar, gefolgt von Th2 und Th17. Die regulatorischen T-Zellen (Treg) stellten die kleinste Population dar, mit signifikant negativer Korrelation zum Arthrose-Stadium. Dies resultiert in einer Zunahme des Ungleichgewichts der pro- und antiinflammatorischen T-Zell-Populationen bei Progression der Erkrankung, welches signifikant mit dem Arthrose-Stadium korreliert (p<0.05). Die Untersuchung mittels CBA bestätigte eine signifikante Steigerung der proinflammatorischen Th1- und Th17-Zytokine (TNF-α und IL-17) in der SF von Arthrose-Stadium I zu Stadium III/IV (p<0.05), während die antiinflammatorischen Th2- und Treg-Zytokine (IL-4, IL-10) in Stadium III/IV abnahmen.
Unsere Daten zeigen, dass die Infiltration der SM und SF mit aktivierten CD4+ T-Zellen bereits im Frühstadium beginnt und signifikant mit Progression der OA zunimmt. Durch selektive Rekrutierung entsteht ein zunehmend proinflammatorisches Milieu im betroffenen Gelenk. Dies lässt den Schluss zu, dass T-Zell-Aktivierung und Polarisierung eine wichtige Rolle bei Beginn und Fortschreiten der OA spielen. Das bessere Verständnis der synovialen inflammatorischen Prozesse könnte langfristig durch die Regulation spezifischer Zellpopulationen zur Etablierung neuer Therapieoptionen dieser Volkserkrankung führen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR14-465
doi: 10.3205/14dkou491, urn:nbn:de:0183-14dkou4913
Published: October 13, 2014
© 2014 Rosshirt et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by G. H. | Jän 14, 2019 | Arthrosetherapie, News
Mengen-und Syntheseänderungen bei Kollagenen und Proteoglykanen in verschiedenen Knorpelschichten im Verlauf der Arthroseentstehung. Vergleich quantitativer Verfahren mit der Photoshop-based image Analyse
Lahm A, Spank H, Kasch R, Rödig J, Erggelet C, Esser J, Merk H
Fragestellung: Ziel der Studie ist die Untersuchung des Ausmaßes der Kollagen I und II-Expression sowie anderer ECM- Bestandteile einschließlich immunhistochemischer Analyse des Gewebemetabolismus während der Entwicklung des Arthroseprozesses.
Quantitative Real-Time-PCR und colorometrische Verfahren wurden mit der EDV-gestützten semiquantitativen Photoshop-based Imageanalyse korreliert, um den Verlauf zu dokumentieren.
Methodik: Insgesamt 40 Knorpelproben (je 20 gemäß ICRS Klassifikation Grad 1b bzw. 3a oder 3b (später Collins und Mc Elligott Grad I in Gruppe A und Grad III in Gruppe B) wurden bei Knie-TEP-Implantationen aus der Notch entnommen, als Standard wurden 15 weitere Biopsien aus gesundem Knorpel genutzt.
Es erfolgte eine in-situ Hybridisierung und Immunhistochemie (u.a.monoklonale Antikörper gegen Kollagen I und II, neues Primerdesign für Aggrecan), quantitative RT- PCR der Proben und Vergleich mittels semiquantitativer Pixelanalyse der Lichtmikroskopien mit PAS-, Safranin-O und Alcian blau sowie der immunhistochemischen Darstellungen im Histogramm Menu (Adobe Photoshop®).
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Den stärksten Kol I Anstieg zeigten die tieferen Schichten des degenerativen Knorpels in der Umgebung von Fissuren sowie schon in der Frühphase flächig in der Superfizial-und oberen Transitionalzone, meist mit strukturellen Schäden und Fibrillationen assoziiert.
Die Analyse zeigt eine uniforme Verteilung von Kol II in den Schichten des gesunden hyalinen Knorpels.
Sein Abfall im degenerativ veränderten Knorpel ist besonders in den oberen Schichten messbar, was stets zu einem Abfall des Gesamtgehaltes führt, obwohl in den unteren Schichten eine gleichbleibender Gehalt bzw. in 30% sogar ein Anstieg meist in isolierter Form (Cluster) auftrat. Der Verlust an Proteoglykan in den stärker degenerativ veränderten Knorpelarealen wurde mit der Photoshop based Image Analyse sowohl in der lichtmikroskopischen als auch immunhistochemischen Analyse mit hoher Korrelation über die Auswertung des Anfärbeverhaltens dokumentiert. Der Proteoglykangehalt nahe der Oberfläche ist physiologisch gering. In der transitionalen Zone unterhalb der Oberflächenzone ist die Safranin-O-Anfärbbarkeit etwas höher, aber geringer als in der tieferen radiären. In beiden Arealen, insbesondere aber der radiären, ist der Gehalt in den geschädigten Knorpelproben verringert, so dass sich letztlich außer in Narben fast eine uniforme Anfärbung mit fortschreitendem Arthrosegrad einstellt.
Die regional unterschiedliche Entwicklung von Kol I und II und Proteoglykangehalt in arthrotischem Knorpel kann präzise und mit der Photoshopanalyse einfach dokumentiert werden, therapeutische Ansätze zur Unterbrechung des degenerativen Prozesses und Stärkung der chondrozytären Antwort können sich in Anbetracht der frühzeitigen Anwesenheit von Kol I in Verbindung mit der grundsätzlichen Fähigkeit der Chondrozyten zur Höherregulierung der Kol II Produktion aus einer Supprimierung der Kol I-Produktion in Verbindung mit Förderung der Kol II Expression ergeben
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR14-135
doi: 10.3205/14dkou490, urn:nbn:de:0183-14dkou4904
Published: October 13, 2014
© 2014 Lahm et al.
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by G. H. | Jän 14, 2019 | Arthrosetherapie, News
Die fokale Sprunggelenks-Arthrose: Früh-Diagnose anhand von Veränderungen der Chondrozyten-Organisation sowohl in gesunden als auch erkrankten Gelenkoberflächen-Arealen
Arnscheidt C, Felka T, Bast S, Meder A, Shiozawa T, Rothdiener M, Stöckle U, Rolauffs B
Fragestellung: Die Frühdiagnose der Arthrose vor dem Auftreten klinischer Symptome und radiologischer Veränderungen ist ein ungelöstes Problem. Bildgebende Verfahren wie MRT oder Röntgen erlauben die Diagnose, wenn substanzielle Knorpeldefekte vorliegen. Bildgebende Methoden zur Früh-Diagnose der Arthrose wären klinisch wertvoll. Moderne Verfahren wie die Multi-Photon-Bildgebung könnten potentiell arthroskopisch angewendet werden und erlauben Untersuchungen lebender Chondrozyten innerhalb der Gelenkoberfläche. Wir untersuchten, ob die räumliche Verteilung der Chondrozyten in Sprunggelenken mit fokaler Arthrose potentiell die Frühdiagnose der Arthrose zulässt.
Methodik: Aus den Talus-Gelenkoberflächen humaner Donoren mit einer fokalen OSG-Arthrose (Collins II) wurden runde Proben (Durchmesser 6mm; n=22) gestanzt. Nur Gewebe außerhalb der fokalen Läsion wurde verwendet. Die Gelenkoberfläche wurde makroskopisch eingeteilt in intakt (1), aufgeraut (2) und gerieft (3). Die Chondrozyten-DNA aller Proben wurde mit Propidium Jodid gefärbt. Es wurden z-Bildstapel (n=99) mit Blick auf die Gelenkoberfläche aufgenommen (LSM 501 Zeiss). Für jeden aufgenommenen Chondrozyten wurden die 3D-Positionen innerhalb der Gelenkoberfläche bestimmt. Mit der Software R und Spatstat wurden Zellzahl/Volumen und der Abstand jedes Chondrozyten zu seinem nächsten Nachbarn bestimmt. Der Typ der Zell-Organisation wurde eingeteilt in normale Zell-Paare (1), Zell-Cluster mit dazwischenliegenden zellfreien Arealen (2) und in eine diffuse Verteilung mit Verlust der physiologischen Ordnung (3).
Ergebnisse und Schlussfolgerung: 4,5% aller Proben waren intakt und beinhaltete 197±15 Chondrozyten per 7,49×106µm3 Gelenkoberfläche, 54,5% war aufgeraut (217±14 Chondrozyten/7,49×106µm3), 40,9% war gerieft (192±24 Chondrozyten/7,49×106µm3). Die Zell-Zell-Abstände zeigten signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Stadien der makroskopischen Gelenkoberflächen-Schäden (p<0,001; Grad 1: 10,7±0,1µm; Grad 2: 13,7±0,1µm; Grad 3: 14,8±0,2µm) und korrelierten mit diesen Stadien (p<0,001). Die Chondrozyten-Organisation veränderte sich mit zunehmender Schädigung. Chondrozytenpaar lagen hauptsächlich in intakten Regionen vor. Cluster und diffuse Verteilungen lagen in geschädigten Regionen vor. Die Chondrozyten-Organisation korrelierte mit dem makroskopischen Gelenkoberflächen-Schaden. Die Zell-Zell-Abstände innhalb der einzelnen Zell-Organisationen zeigten signifikante Unterschiede (p<0,001): sie nahmen um 18,9% in OA-Clustern zu und waren in ordnungslos angeordneten Chondrozyten um 22% kürzer und korrelierten mit der Zell-Organisation (p<0,001).
Die lokale Zellverteilung humaner Chondrozyten in der Talus-Gelenkoberfläche zeigt typische Veränderungen in Gelenken mit fokaler Arthrose. Diese Veränderungen sind in wenig geschädigten Arealen und außerhalb einer Arthrose-Läsion erkennbar. Die lokale Verteilung der Gelenkoberflächen-Chondrozyten ist ein vielversprechender Kandidat zur Frühdiagnose der Arthrose vor dem Auftreten substanzieller Knorpeldefekte.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR14-505
doi: 10.3205/14dkou489, urn:nbn:de:0183-14dkou4897
Published: October 13, 2014
© 2014 Arnscheidt et al.
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by G. H. | Nov 20, 2018 | Anti Aging, Arthrosetherapie, News
BMP9: Eine potentere Alternative zu BMP2 und BMP7 für die klinische Anwendung?
Ehnert S, Freude T, Lacorte P, Schröter S, Ochs G, Nussler A
Fragestellung: Bone morphogenetic proteins (BMPs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Proliferation und Reifung von Osteoblasten. Seit einigen Jahren werden BMP-2 und BMP-7 klinisch angewendet. Trotz der nachgewiesenen positiven Effekten dieser rekombinanten humanen (rh)BMPs bei der Behandlung von Pseudarthrosen, ist die Anwendung mit hohen Kosten verbunden. Darüber hinaus existieren Berichte über Komplikationen (vertebrale Osteolyse, Radikulopathie, Weichteilschwellung) und hohe Ausfallraten. Adenovirale Überexpression verschiedener BMPs zeigte, dass BMP9 eines der potentesten osteogenen BMPs ist. Allerdings konnte BMP9 lange nicht als rekombinantes Protein hergestellt werden, wodurch wenig über dessen direkte biologische Funktion bekannt ist. Ziel dieser Arbeit ist es deshalb, die osteogenen Effekte von rhBMP9, im Vergleich zu rhBMP2 und rhBMP7, auf humane Osteoblasten zu untersuchen.
Methodik: Primäre humane Osteoblasten wurden durch Kollagenaseverdau aus Spongiosa von Patienten gewonnen (Ethikgenehmigung 364/2012BO2). Als Kontrolle dienten murine prämyoblastische Vorläuferzellen (C2C12 Zellen). Die Zellen wurden mit rhBMP2, rhBMP7 oder rhBMP9 stimuliert. Als funktionelle Parameter wurden Viabilität/Proliferation, Alkalische Phosphatase (AP) Aktivität sowie Bildung mineralisierter Matrix (von Kossa und Alizarin Rot Färbung) bestimmt. Genexpressionsänderungen wurden mittels RT-PCR bestimmt. Die Ergebnisse der Gruppen wurden mittels ANOVA verglichen.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Im Durchschnitt induzieren alle drei eingesetzten rhBMPs die Proliferation oder AP-Aktivität der primären humanen Osteoblasten. In beiden Fällen wird dadurch mehr Phosphat für die Bildung Mineralisierter Matrix bereitgestellt. Interessanterweise, mussten von rhBMP9 (5-10 ng/ml) weit weniger Protein eingesetzt werden um vergleichbare Ergebnisse zu rhBMP2 (50-100 ng/ml) und rhBMP7 (50-100 ng/ml) zu erreichen. Allerdings entspricht die Ausfallrate den klinischen Berichten und es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den 3 untersuchten rhBMPs ermittelt werden. Die Ausfallrate scheint indirekt im Zusammenhang mit die Aktivierung (kanonisch und nicht-kanonisch) des Wnt Signalweges zu stehen, da es in der Respondergruppe signifikante Unterschiede in der Genexpression der bekannten Wnt Inhibitoren SOST, DKK1 und DKK2 gibt. Dies wird bestätigt durch Versuche mit C2C12 Zellen, in welchen der Zellkulturüberstand der Osteoblasten die Effekte von rhBMP9 neutralisierte.
Zusammenfassend, bestätigen unsere Ergebnisse die Annahme, dass rhBMP9 eine potentere Alternative zu rhBMP2 und rhBMP7 darstellt, da für vergleichbare Effekte nur ca. 1/10 des rekombinanten Proteins benötigt wurde. Allerdings zeigte rhBMP9 in vitro dieselbe Ausfallrate wie rhBMP2 und rhBMP7. Bedingt durch die Regulation der Wnt Inhibitoren SOST, DKK1 und DKK2 scheint die Ausfallrate indirekt im Zusammenhang mit der Aktivierung des Wnt Signalweges zu stehen. Durch die genaue Identifizierung dieser Mechanismen könnte die BMP Therapie weiter optimiert werden.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR12-1109
doi: 10.3205/14dkou477, urn:nbn:de:0183-14dkou4776
Published: October 13, 2014
© 2014 Ehnert et al.
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