by G. H. | Mrz 11, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Die Wahl des Hydrogels reguliert die differenzielle Syntheseleistung humaner Chondrozyten unter biomechanischer Stimulation
Rothdiener M, Felka T, Uynuk-Ool T, Fischer A, Aicher WK, Stöckle U, Grodzinsky AJ, Rolauffs B
Fragestellung: Der hyaline Gelenkknorpel ist ein druck- und biegungselastisches, gefäßloses Stützgewebe. Seine Zellen, die Chondrozyten, sind für die Produktion, Erhaltung und Reparatur der extrazellulären Matrix (EZM) verantwortlich. Die perizelluläre Matrix (PZM), die die Chondrozyten innerhalb der EZM umgibt, überträgt biomechanische und biochemische Signale zwischen der Zelle und der EZM1. Die Erkrankung der Osteoarthrose (OA) geht mit der Degeneration von EZM und PZM einher. Wir haben gezeigt, dass OA-Chondrozyten ohne PZM in vitro in ihren zellulären Funktionen OA-Chondrozyten mit PZM unterlegen sind [1]. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Auswirkung biomechanischer Stimulation auf die Biosynthese von OA-Chondrozyten mit PZM, auch in Abhängigkeit des OA-Grads. Die Eignung von arthrotischem Knorpelgewebe für die autologe Therapie sollte so überprüft werden.
Methodik: Chondrozyten mit PZM wurden im Zuge von Kniegelenkersatz enzymatisch aus humanem Knorpelgewebe gewonnen (n=42; Mittel: 68 Jahre). Die Zellen wurden entweder in einem Peptid Hydrogel (Sequenz AcN-KLDLKLDLKLDL-CNH2) oder einem Dextran Hydrogel (Cellendes, Reutlingen) unter Standardbedingungen (F12:DMEM 1:1, 10% FCS, 0,1% Ascorbat) kultiviert und biomechanisch stimuliert (6 Wochen intermittierend, 2.5% dynamische Kompression). Synthese und Abbau von Kollagen II wurden mittels CPII Propeptid bzw. C2C Neoepitop ELISA (Ibex, CAN) bestimmt, der Glycosaminoglycan (GAG) -Gehalt mittels Dimethylmethylenblau (DMMB) -Assay. Der OA-Grad wurde mit Hilfe der Kellgren-Lawrence Skala quantifiziert.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: In unstimulierten Peptid Hydrogel Kulturen korrelierte die Kollagen II Synthese mit dem OA-Grad (p<0,05). Biomechanisch stimulierte Chondrozyten produzierten im Vergleich zu unstimulierten Kontrollen signifikant höhere Mengen an CPII (p<0,05) und C2C (p<0,05). Dabei konnten Kulturen mit ohnehin guter Kollagen II Synthese durch Stimulation nicht gesteigert werden, während Kulturen mit geringer Kollagen II Synthese durch Stimulation signifikant (p<0,05) gegenüber den Kontrollen auf das Niveau der guten Kulturen gesteigert werden konnten. Die GAG Synthese konnte durch Stimulation im Peptid Hydrogel nicht gesteigert werden. Im Gegensatz dazu synthetisierten die im Dextran Hydrogel stimulierten Chondrozyten signifikant höhere Mengen an GAG (p<0,05) als die unstimulierten Kontrollen. Die Kollagen II Synthese stieg hingegen erst nach 6 wöchiger Stimulation gegenüber der Kontrolle signifikant an (p<0,05).
Die Art des gewählten Hydrogels war verantwortlich für die differenzielle Hochregulation der Kollagen II bzw. GAG Synthese unter biomechanischer Stimulation. Diese zeigte auch eine Abhängigkeit von der Schwere der OA. Generell konnten arthrotische Chondrozyten mit PZM unter Erhaltung ihrer Funktion effektiv isoliert und kultiviert werden.
Literatur
1.Rothdiener M, et al. OA-Chondrone übertreffen OA-Chondrozyten in ihrer zellulären Funktion: eine Rolle im Tissue Engineering? In: Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2012). Berlin, 23.-26.10.2012. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2012. DocGR19-859. DOI: 10.3205/12dkou488
2.Poole CA. Articular cartilage chondrons: form, function and failure. J Anat. 1997 Jul;191 (Pt 1):1-13. DOI: 10.1046/j.1469-7580.1997.19110001.x
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR16-987
doi: 10.3205/14dkou514 , urn:nbn:de:0183-14dkou5147
Published: October 13, 2014
© 2014 Rothdiener et al.
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by G. H. | Mrz 11, 2019 | News, Spezifische Orthopädie
Vergleich von plättchenreichem Plasma (PRP) und Thrombozytenlysat (TL) zur Stimulation von humanen Tenozyten in vitro
Schmidt T, Klatte F, Scheffler S, Wildemann B, Pruss A
Fragestellung: Die Nutzung von PRP zur Stimulation der Heilung ist trotz fehlender Evidenz eine häufig angewandte Therapieform. TL stellen eine Alternative zum PRP dar. Zur Herstellung werden durch Apherese gewonnene Thrombozytenkonzentrate mit einem Thrombozytengehalt von bis zu 1011 /ml verwendet. Diese werden eingefroren, was zur Lyse der Thrombozyten und Freisetzung der enthaltenen Wachstumsfaktoren führt. Das zellfreie, Wachstumsfaktor haltige TL wird in der Augenheilkunde schon erfolgreich eingesetzt. Vorteile zum PRP liegen neben dem höheren Thrombozytengehalt in der Lagerbarkeit. Dies ermöglicht repetitive Anwendungen und eine Analyse der Zusammensetzung und damit Standardisierung des Produktes vor der Anwendung
Methodik: PRP und TL eines männlichen und eines weiblichen Spenders wurden entsprechend den Herstellerangaben präpariert. Tenozyten aus Supraspinatussehnen-Biopsien von 4 männlichen und 4 weiblichen Spendern wurden 5 Tage mit 10% v/v PRP oder TL in Medium mit 2% FCS stimuliert. Als Positivkontrolle diente Medium mit 10% FCS, als Negativkontrolle Medium mit 2% FCS. Zu Beginn und am Ende der Stimulation wurde die Zellaktivität mittels Alamar Blue Test gemessen und an Tag 5 die RNA aus den Zellen isoliert. Mittels qRT-PCR wurde die Expression von Kollagen I, Kollagen III, Decorin, IL-1β und TNF-α ermittelt.
Statistik: Mann-Whitney U test, bonferroni-holm
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Der Thrombozytengehalt der TL lag mit 1,27 (männlich) bzw. 1,22 (weiblich) x1011/ml deutlich über dem der PRP’s mit 6,6 (männlich) bzw. 3,0 (weiblich) x108/ml.
Die Zellaktivität nach 5 Tagen war in allen Gruppen signifikant erhöht im Vergleich zur Negativkontrolle. Die Kollagen I Expression war in allen Gruppen niedriger im Vergleich zur Negativkontrolle, wobei die Kollagen I Expression in den Lysatgruppen signifikant höher war im Vergleich zu beiden PRP Gruppen. Die Kollagen III Expression wurde durch beide PRP’s sowie dem weiblichen TL signifikant erhöht im Vergleich zur Negativkontrolle.
Die Expression von Decorin und TNF-α ergab keine Unterschiede zwischen den Gruppen. Interessanterweise zeigte sich eine deutliche Erhöhung der IL-1β Expression in 6 von 8 Tenozytenkulturen nach Stimulation mit weiblichem PRP und in 2 von 8 Kulturen stimuliert mit männlichem PRP gegenüber der Negativkontrolle jedoch nicht nach TL Gabe. Dies konnte aufgrund der starken Schwankungen der Werte statistisch nicht verifiziert werden.
Eine verbesserte Zellaktivität der Tenozyten in vivo könnte die Sehnen-Heilung fördern. Inwiefern sich eine verringerte Kollagen I bzw. erhöhte Kollagen III Expression auf die Heilung auswirkt, müsste in weiteren Studien untersucht werden. PRP’s und TL stellen eine Möglichkeit zur Stimulation der Heilung dar, da sie wichtige Wachstumsfaktoren enthalten, keine Nebenwirkungen zeigen und kostengünstig sind. Der Vorteil des TLs ist zudem die Lagerbarkeit und somit eine mögliche repetitive Verwendung sowie die Möglichkeit zur Charakterisierung vor der Anwendung zur Standardisierung der Behandlung.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR16-1452
doi: 10.3205/14dkou513 , urn:nbn:de:0183-14dkou5131
Published: October 13, 2014
© 2014 Schmidt et al.
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by G. H. | Mrz 11, 2019 | News, Schulter
Hat Platelet Rich-Plasma (ACP) einen regenerativen Effekt auf Sehnenzellen der humanen Rotatorenmanschette?
Pauly S, Klatte F, Stahnke K, Greiner S, Scheibel M, Wildemann B
Fragestellung: Platelet rich- Plasma (PRP) wird in verschiedenen Anwendungsformen als körpereigene Augmentation für diverse muskuloskeletale Rekonstruktionen bzw. Regenerationsprozesse vertrieben- unter anderem als autologes konditioniertes Plasma (ACP, Arthrex). Hinsichtlich der Ergebnisse nach ACP-augmentierten Rotatorenmanschetten-Rekonstruktionen existieren klinische Studien mit heterogenem Resultat. Bisher liegt aber keine Untersuchung des ACP-Effektes auf Sehnenzellkulturen (Tenozyten) vor.
Gegenstand der Studie ist daher die Untersuchung von 1) Wachstumsfaktor-Gehalt von ACP, 2) Zellproliferation und Kollagen-Produktion von Tenozyten der humanen Rotatorenmanschette unter Einfluss von spenderindividuellem ACP.
Methodik: N=24 Tenozytenkulturen von Donor-Patienten beiderlei Geschlechts (je n=12 m/w) wurden nach etabliertem Protokoll kultiviert. Die periphervenöse Blutabnahme der Donor-Patienten mit nachfolgender Herstellung von ACP (Zentrifugation etc.) erfolgte nach Herstellerangaben zu einem späteren Zeitpunkt. Es handelt sich um die erste Studie von individuellem (nicht gepooltem) ACP an autologen Sehnenzellkulturen (patientenspezifisch).
Das frische ACP (nicht-gefroren) wurde
- quantitativ auf muskuloskeletale Wachstumsfaktoren untersucht (PDGF-AB, IGF-1, TGF-β1, BMP-7, BMP-12)
- dem intraindividuellen Zellpool plus Medium (FCS) zugeführt und nach 5d auf Zellwachstum (Alamar Blue Assay) und Collagen-I Synthese untersucht (vgl. Positiv-/Negativkontrolle).
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Im ACP wurden muskuloskeletale Wachstumsfaktoren nachgewiesen, die an der Sehnen-Knochen-Regeneration beteiligt sind. Wachstumsfaktoren der BMP-Familie wurden hingegen nicht in relevanter Menge nachgewiesen.
Eine ACP-abhängige Steigerung der Zellproliferation gegenüber den Kontrollkulturen wurde beobachtet.
Die Gesamt-Kollagen-I Produktion war unter Einfluss von ACP signifikant erhöht (relativiert zur Zellproliferation sign. reduziert).
ACP scheint auf Tenozyten der Rotatorenmanschette in vitro einen anabolen Effekt zu haben. Eine gesteigerte Produktion von Kollagen I am Footprint ist erwünscht, um eine belastbare Regeneration zu ermöglichen. Jedoch schwanken physiologisch die zellulären/viskösen Charakteristika des venösen Blutplasmas, also auch des produzierten PRP/ACP. Hier sind ggf. Standardisierungen sowie weitere in vitro- und klinische Untersuchungen notwendig, um den Effekt von PRP/ACP auf die RM-Regeneration abschliessend beurteilen zu können.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR16-802
doi: 10.3205/14dkou512 , urn:nbn:de:0183-14dkou5121
Published: October 13, 2014
© 2014 Pauly et al.
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by G. H. | Mrz 4, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Autologe Tenozyten führen in Kombination mit einem resorbierbaren Kollagen-Scaffold zur verbesserten biomechanischen und histologischen Sehnenregeneration bei Rotatorenmanschettendefekten im Großtier
Roßbach BP, Pietschmann MF, Kempfert L, Ficklscherer A, Gülecyüz MF, Schmitt B, Ullamann T, Müller PE
Fragestellung: Die Regeneration von Rotatorenmanschettendefekten wird zum großen Teil durch die Gewebebiologie nach Rekonstruktion bestimmt. Hierbei führen unzureichende Vaskularisierung, Inflammation und Bildung von Ossifikationen zu Rerupturen und unbefriedigenden klinischen Ergebnissen. Eine neue Methode zur Sehnenregeneration stellt die Verwendung von autologen Tenozyten mit Scaffolds dar. Aufgrund der Größe sowie der Ähnlichkeit der Strukturen zur humanen Anatomie eignet sich hierbei das Großtiermodell am besten. Hypothese unserer Studie war, dass autologe Tenozyten in Kombination mit einem resorbierbaren Kollagen-Scaffold zu einer verbesserten biomechanischen und histologischen Sehnenregeneration von Rotatorenmanschettendefekten im Großtier führen.
Methodik: Nach Gewebebiopsie an der Patellasehne an acht Schafen, enzymatischer Verdauung und Kultivierung der Zellen in einer high-density Kultur wurden zehn Millionen autologe Tenozyten auf einem resorbierbaren Kollagen-Scaffold besiedelt und in einen critical-size-Defekt am Sehnen-Knochen-Übergang der rechten Infraspinatussehne dieser Tiere implantiert (Gruppe III). Als Vergleichsgruppen dienten jeweils acht Schafe mit Implantation eines unbesiedelten Scaffolds (Gruppe II) bzw. mit reiner Defektsetzung (Gruppe I). Die Euthanasie erfolgte 12 Wochen postoperativ und die gewonnenen Sehnenregenerate wurden biomechanisch und histologisch untersucht. Die kontralateralen Schultern dienten hierbei als Kontrollgruppe.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: In der biomechanischen Analyse wurde jedes Sehnenregenerat mit einer Vorlast von 10 N und einer Rate von 500 mm/min unter Dislokationskontrolle bis zum Versagen getestet. Bei gesunden Kontrollsehnen wurde eine durchschnittliche maximale Reißkraft von 2995 N ermittelt. Gruppe III mit besiedeltem Scaffold wies mit einem Durchschnittswert von 2516 N eine deutliche biomechanische Überlegenheit im Vergleich zu den Gruppen I mit Defektsetzung und II mit unbesiedeltem Scaffold mit 2004 N bzw. 2088 N auf. In der histologischen Aufbereitung konnte in Gruppe III im Gegensatz zu den beiden anderen Gruppen durch die Verwendung von autologen Tenozyten eine geringere Entzündungsreaktion, ein besser angeordneter Faserverlauf sowie eine vermehrte Kollagen- als auch Proteoglykan-Synthese im neuen Sehnenregenerat nachgewiesen werden.
Autologe Tenozyten führen in Kombination mit einem resorbierbaren Kollagen-Scaffold zur verbesserten biomechanischen und histologischen Sehnenregeneration gegenüber unbehandelten Defekten bzw. Defektauffüllung mit unbesiedeltem Scaffold bei Rotatorenmanschettendefekten im Großtier. Es könnte sich bei dieser Methode um einen vielversprechenden Ansatz zur Reparatur von nicht verschließbaren Sehnendefekten handeln.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR16-227
doi: 10.3205/14dkou511 , urn:nbn:de:0183-14dkou5111
Published: October 13, 2014
© 2014 Roßbach et al.
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by G. H. | Mrz 4, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Regenerationsfähigkeit der irreversibel verfetteten Myozyten der Rotatorenmanschette nach Transplantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen und Myozyten am Ratten-Modell – Erste Ergebnisse
Gülecyüz M, Eichmüller K, Pietschmann MF, Ficklscherer A, Roßbach BP, Niethammer TR, Müller PE
Fragestellung: Rotatorenmanschettenrupturen führen zu Funktionseinschränkungen und auf zellulärer Ebene zur irreversiblen Muskelverfettung. Im Tiermodell konnte nach RM-Naht keine spontane Regeneration der Verfettung beobachtet werden. Am Myocardischämie-Modell der Ratte konnte die lokale Applikation von mesenchymalen Stammzellen (MSC) die Regeneration der Kardiomyozyten fördern. Die Regenerationsfähigkeit der irreversiblen Skelettmuskelverfettung durch MSC wurde bis dato nicht untersucht. Diese Studie soll untersuchen ob eine fettige RM-Degeneration am Ratten-Modell mit lokaler Transplantation von allogenen Myozyten und MSC positiv zu beeinlussen ist.
Methodik: Nach Supraspinatussehnendurchtrennung wurde die Verfettung von Inzucht-Ratten über 4 bzw. 8 Wochen verursacht. Nach 4 Wochen wurden die Sehnenstümpfe von 64 Ratten (4 Gruppen à n= 6) transossär refixiert: die Kontrollgruppe wurde mit NaCl infiltriert; die Spontanheilungsgruppe wurde nach der Refixierung nicht behandelt; die MSC-Gruppe erhielt eine Infiltration von 5×10^6 allogenen MSC von Spendertieren; die Myozytengruppe erhielt eine Infiltration von 5×10^6 allogenen Myozyten von Spendertieren. Nach einer 4-wöchigen Heilungsphase (ings. 8 Wochen nach Defeksetzung) wurden die Ratten euthanasiert. Die Muskelmasse und Verfettung wurde mit zwei Vergleichsgruppen (Degeneration nach 4 bzw. 8 Wochen) und mit der nicht-behandelten Gegenseite quantitativ und histologisch verglichen.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die mit MSC und Myozyten behandelten Gruppen zeigten eine signifikant höhere Muskelmasse im Vergleich zu der Defektgruppe nach 4 Wochen (Abb. 1). Eine Muskelmassenzunahme der MSC- und Myozyten-Gruppe im Vergleich zu der Defektgruppe nach 8 Wochen, Kontroll- oder Spontanheilungsgruppe konnte nicht beobachtet werden (Abb. 1). Die behandelten Gruppen zeigten im Vergleich zu der nicht-behandelten linken Seite (Tötung nach 4 Wochen) keinen signifikanten Unterschied (Abb. 3). Die nicht-behandelte linke Seite (Tötung nach 8 Wochen) zeigte aber eine signifikant höhere Muskelmasse im Vergleich zu den behandelten Gruppen (Abb. 4).
In diesem Defektmodell zeigt die Infiltration von allogenen Myozyten und MSC keine signifikante Überlegenheit im Vergleich zu der Kontroll- oder Spontanheilungsgruppe hinsichtlich der Muskelmassenzunahme. Dieses Phänomen lässt sich am ehesten durch den stark ausgeprägten Spontanheilungsprozess der Ratte erklären; wir beobachteten bei jedem Tier in jedem der behandelten Gruppen die Entwicklung eines Bindegewebestranges von der RM-Muskulatur zum Humeruskopf. Dieses Gewebe könnte die Funktion der abgesetzten Sehne als Neosehne übernommen und die vollständige Degeneration der Supraspinatussehne verhindert haben.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR16-946
doi: 10.3205/14dkou510 , urn:nbn:de:0183-14dkou5101
Published: October 13, 2014
© 2014 Gülecyüz et al.
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